[发明专利]胞内劳森菌的培养方法及应用

说明书

本发明公开了一种胞内劳森菌的培养方法，包括以下步骤：步骤1：贴壁培养猪肠道细胞；步骤2：待细胞贴壁培养6～8h，将胞内劳森菌与细胞培养液按体积比0.01～1:1接种至细胞中，置于改良的微需氧环境中培养1～96h；步骤3：胰酶消化感染的细胞后，收集感染细胞，并用细胞冻存液重悬感染细胞，转入液氮罐中保存。还公开由所述的培养方法培养的胞内劳森菌的应用，应用于胞内劳森菌分离培养和病原性特征的研究中。本发明应用猪肠道细胞来培养胞内劳森菌，严格模拟宿主体内的体外培养环境，并且应用改良后的微需氧培养箱来培养胞内劳森菌，操作简单，培养周期短，成本低，大大增加培养胞内劳森菌的成功率。

技术领域

本发明属于兽用生物技术领域，具体涉及一种胞内劳森菌的培养方法及应用。

背景技术

胞内劳森菌(Lawsonia Intracellularis，LI)属于脱硫弧菌属，革兰氏阴性菌，呈弧形弯曲状、逗点状或S形，大小为1.25～1.75μm×0.25～0.43μm，专性寄生于动物肠道细胞中，可引起以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞腺瘤样增生为特征的猪增生性肠炎(PPE)。虽PPE死亡率不高，但该病可引起病猪腹泻、生长缓慢等临床症状，严重降低动物的饲料利用率，进而造成巨大的经济损失。据报道，美国和英国每年因PPE造成的损失分别高达2000万美元、400万英镑。在欧洲，估计每年该病对每头育肥猪造成的损失超过1欧元。此外，该病呈世界规模流行，感染率非常高。据报道，加拿大、芬兰、巴西、法国、南非、希腊、泰国、印度、日本、朝鲜、中国等20多个国家均有LI感染，特别是在欧美国家发病率较高。在自然界中LI能通过多种途径传播，如鸟类、鼠、昆虫等动物性传播，人员、设备、车辆等流动性传播。为了更好地防治PPE，LI的培养和鉴定显得尤为重要。

LI属于严格的胞内菌，不能在常规的培养基中生长，只能生长在细胞中，如IEC-18,McCoys,Hep-2，henle407和IGPC-1651等细胞；此外，该菌微需氧且必须在一个特殊的气体环境中才可以生长。因其特殊的培养条件，目前全世界成功分离到的菌株不足25株，现保存的菌株更少，国内至今没有成功分离培养的相关报道。现如今，对于LI的培养，使用最多的是智能多气培养箱和微需氧产气袋。但是智能多气培养箱价格昂贵，很多实验室难以达到相应硬件要求；而微需氧产气袋虽然价格便宜，但是操作不便，使实验难以控制，对细胞和细菌的培养有一定的影响。

另外，利用宿主细胞培养细菌可以更好地反应细菌在宿主体内的侵袭和繁殖特性，增加分离和培养LI的成功率。但目前报道中培养LI所用的细胞，不是来源于宿主细胞，不能完全反应胞内劳森菌在猪胃肠道的感染特性；此外，现有技术细胞培养周期长，对于该菌后期的分离检测很不利。

鉴于现有技术存在的问题，本发明通过改进微需氧培养培养条件，采用宿主细胞来培养LI，通过普通PCR、荧光定量PCR和过氧化物酶单层染色(IPMA)的方法来鉴定其培养结果，并优化细菌感染时间和剂量，以及制作生长曲线，这些对于分离LI以及后期研究PPE具有重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种胞内劳森菌的培养方法，改变了传统的LI培养方法，操作简单，培养周期短，利于后期对于该菌进行分离和鉴定。

本发明还有一个目的是提供一种由所述的培养方法培养的胞内劳森菌的应用，应用于胞内劳森菌分离培养和病原性特征的研究中。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种胞内劳森菌的培养方法，包括以下步骤：

步骤1：贴壁培养猪肠道细胞；

步骤2：待所述猪肠道细胞贴壁培养6～8h，将胞内劳森菌与细胞培养液按体积比0.01～1:1接种至细胞中，置于改良的微需氧环境中培养1～96h；