[发明专利]一种同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的电化学方法

说明书

本发明属于生物传感器和电化学检测领域，涉及一种同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的电化学方法；步骤为：首先制备得到丝网印刷电极；然后制备得到AFB1适配体与OTA适配体修饰电极，再将适配体修饰电极依次浸入AFB1、OTA、Tris‑HCl缓冲溶液配制的标准溶液和AFB1适配体互补链、OTA适配体互补链、Tris‑HCl缓冲溶液的混合液；最后，根据二茂铁的峰电流值、亚甲基蓝的峰电流值与AFB1和OTA浓度的关系，分别建立标准曲线；通过检测待测液的二茂铁和亚甲基蓝的峰电流值，即可实现样品中AFB1和OTA的同时检测；本发明能够对两种目标物同时检测，操作简便，并具有高灵敏度和高选择性。

技术领域

本发明属于生物传感器和电化学检测领域，具体涉及一种同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的电化学方法。

背景技术

真菌毒素是真菌在生长过程所产生的次级代谢物，对人类和动物具有毒害作用。黄曲霉毒素主要是黄曲霉和寄生曲霉产生的二级代谢产物，是一种毒性极强的真菌毒素。黄曲霉毒素主要对肝脏组织具有破坏作用，严重会导致肝癌甚至死亡。在污染食品的黄曲霉毒素中以黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)最常见，毒性和致癌性也最强。赭曲霉毒素是由多种曲霉菌和青霉菌产生的化合物，共有A、B、C、D四类，其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)的污染率、污染水平和毒性最高。

真菌毒素的检测方法主要有气相色谱、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。尽管这些方法可以实现真菌毒素的检测，但需要昂贵的仪器，专业的操作人员，和复杂的检测程序，难以满足现场快速检测的需要。电化学技术具有高灵敏度、易操作、低成本等优势，已经被用于真菌毒素的检测。目前，真菌毒素的电化学检测主要针对某一种真菌毒素，而同时检测两种真菌毒素的电化学检测方法却鲜见报道。本发明开发了一种同时检测AFB1和OTA两种真菌毒素的电化学方法，能够实现AFB1和OTA两种真菌毒素的同时检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸适配体的AFB1和OTA的电化学同时检测方法，其检测具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优势，可用于食品安全领域中真菌毒素的检测。

为了实现上述目的，本发明通过丝网印刷技术，制备具有两个工作电极的丝网印刷电极，采用电沉积方法在工作电极表面修饰金纳米粒子，然后通过自组装的方式在两个工作电极表面分别修饰AFB1和OTA的核酸适配体，利用真菌毒素与适配体的特异性结合，影响互补链与适配体的杂交，依据互补链末端标记物的伏安信号，实现AFB1和OTA的同时检测。本发明所提供的检测方法，以具有不同氧化还原电位的标记物的伏安信号为定量标准，同时对两种真菌毒素进行定量测定。

上述的基于核酸适配体的AFB1和OTA两种真菌毒素的电化学同时检测方法，其具体步骤如下：

(1)制备得到丝网印刷电极，所述丝网印刷电极包括对电极、工作电极一、工作电极二和参比电极；

丝网印刷电极制备的具体步骤：首先，使用计算机绘图软件设计电极形状，通过激光打印方法，分别制备用于印刷银浆、碳浆和绝缘油墨的三块网版；首先印刷银浆，干燥后得到三个平行且相互独立的银浆图案，其中位于中间的银浆图案为Y形，Y形两侧的银浆图案为条形；然后，再印刷碳浆，干燥后得到三个独立的碳浆图案，其中一个碳浆图案为弧形，与其中一个条形银浆图案的末端相连，另外两个碳浆图案为椭圆形，分别与Y形银浆图案的两个末端相连；最后，印刷绝缘油墨干燥后得到矩形的绝缘油墨图案，所述矩形绝缘油墨覆盖碳浆图案与银浆图案的连接处以及部分银浆图案；所述干燥的条件均为70～90℃，干燥时间均为10～60min。

(2)适配体修饰电极的制备：

S1、首先，将步骤(1)制备的丝网印刷电极浸入氯金酸溶液中，在丝网印刷电极的2个工作电极上施加恒定电位，保持一段时间后，取出丝网印刷电极，再次置于硫酸溶液中，进行循环伏安扫描，活化金纳米粒子，得到金纳米粒子修饰的丝网印刷电极；