[发明专利]一种高效筛选异丁醇高产菌株的BmoR突变体

说明书

BmoR是来源于假单胞菌中的转录因子，其信号分子包括多种高级醇，已经被应作生物传感器筛选正丁醇和异丁醇高产菌株。然而天然转录因子对异丁醇和正丁醇的相应范围只有0‑40mM，这样无法筛选到真正高产的菌株，从而无法满足工业生产的需求。为了解决上述问题，本发明使用蛋白质工程改造的方法改造BmoR。通过随机突变，结构模拟和定点突变的方式，得到了一个性能优异的BmoR组合突变体F276A/E627N。通过底物正丁醇和异丁醇的浓度梯度外源添加实验，验证其对正丁醇和异丁醇的响应范围提高至0‑100mM，并进一步在异丁醇高产菌株中进行了功能验证。本发明通过蛋白质工程的方法对天然转录因子进行了改造，得到性能更加优异的突变体，为转录因子应用于工业生产提供了范例。

技术领域

本发明涉及一种高效筛选异丁醇高产菌株的BmoR突变体，属于生物工程技术领域。

背景技术

随着全球的能源和环境问题的发展，绿色环保的可再生生物燃料已经日益受到重视。异丁醇作为支链高级醇，因其优异的性能而有望应用成为新一代生物燃料，异丁醇的生物合成受到了更加广泛的关注和应用。随着代谢工程与和合成生物学的发展，异丁醇的生物合成已经在大肠杆菌[1]，酿酒酵母[2]以及谷氨酸棒状杆菌[3]等多种微生物宿主中实现。尽管目前异丁醇已经实现了较高的产量，但是仍然无法满足工业生产的需求。通过改造宿主，挖掘高性能的酶以及代谢途径调控是提高目标化合物产量的常用手段。经过诱变得到的微生物宿主随机突变文库，需要通过高通量筛选的方法得到过量生产目标化合物的突变体，但是如何在这些广泛的文库中确定最好的变体是一个缓慢和繁琐的工程。生物传感器生物传感器(Biosensor)作为一种合成生物学中新兴的工具，是一种基于自身基因线路编码的组件[4]。通过设计和构建生物传感器，可以使其动态地响应信号物质浓度的变化从而输出便于检测的蛋白信号，因此生物传感器是一种快速和高通量评估候选途径变体的有前景的工具[5]。

基于转录因子(Transcription Factors，TF)的生物传感器的应用最为广泛。转录因子可以灵敏地响应环境和细胞内条件的变化，从而开启相关基因的转录和翻译以适应外部环境。基于转录因子的特性，它们已被用于建立生物传感器系统以检测环境变化，如代谢物水平，并改变基因表达作为回应，可以导致基因抑制或激活，并将配体浓度的微小变化转化为基因表达蛋白质丰度的大变化。目前，基于转录因子的生物传感器已经广泛应用于高产菌株筛选或富集[6,7]，代谢途径中相关酶的高通量筛选[8]，以及代谢途径调控[9,10]等方面。BmoR是假单胞杆菌(Pseudomonas butanovora)的正烷烃代谢途径中的转录因子，调控烷烃单加氧酶的σ⁵⁴依赖型启动子P_bmo，其主要信号分子是C2-C5的直链醇[11]。基于BmoR转录因子的调控机制，之前的研究已经成功将其改造成生物传感器并用于正丁醇和异丁醇高产菌株的筛选[12,13]。然而，由于野生型BmoR的底物响应范围只有0-40mM(0-2.96g/L)，检测上限较低，无法用于筛选产量更高的突变体(2.96g/L以上)，而目前异丁醇生产菌株的产量通常在3g/L之上，因而使用天然BmoR的生物传感器无法直接实现有效筛选。BmoR作为细菌增强因子结合蛋白(bEBP)的成员，对于σ⁵⁴依赖型启动子的激活是必需的[14]；其中心结构域和C端结构相对保守，功能也比较确定，但是N端结构和激活机理并没有研究报道。

为了进一步提高基于转录因子BmoR的生物传感器的筛选效率，本发明采用了蛋白质工程的方法改造BmoR。首先通过易错PCR的方法建立了BmoR突变库，对突变位点分布在不同功能域的突变体进行分析。随后通过同源建模对BmoR-异丁醇复合体的结构进行了模拟，在此基础上挑选了异丁醇结合位点周围的F276位点，得到了K_m升高，底物响应范围升高的N端突变体F276A，但是响应强度却明显下降。从C端突变体中得到了响应强度明显提高的突变体E627N，然而底物响应范围并未发生显著变化。基于以上结果，我们构建了N端和C端组合突变体F276A/E627N，不仅具有更宽的底物检测范围(0-100mM)，而且响应强度较高。