[发明专利]一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法

说明书

细菌是代谢工程中的主要宿主，基因组编辑是细菌工程改造的主要途径，而现有的针对细菌的基因组编辑方法都需要过表达外源的同源重组系统或非同源末端连接系统。本发明公开了一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法。本发明所提供的基因组编辑方法是按照包括以下步骤进行：构建一个双质粒基因组编辑系统，通过转化将该系统导入待编辑的菌株。将含有基因组编辑系统的菌株在液体培养基中培养使其进行繁殖，待细胞数目足够时加入诱导剂诱导CRISPR/Cas9系统表达，随后发生DNA双链切割和修复，实现基因组编辑。本发明先通过细胞繁殖增加细胞的数量和活性再启动基因组编辑，显著提高了基因组编辑效率，并成功在大肠杆菌中实现了基因敲除和大片段删除。

技术领域

本发明涉及一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

合成生物学是21世纪最重要的生物技术平台，合成生物学在生物能源、生物材料、生物医药、生物修复等领域具有广泛的应用。基因组编辑技术与DNA组装技术、定向进化技术一起组成合成生物学的三大前沿技术。

细菌是合成生物学中的主要宿主生物，对微生物的代谢工程改造是合成生物学中必不可少的环节，而基因组编辑又是细菌代谢工程改造的主要手段。

CRISPR/Cas9技术已经被广泛应用于细菌的基因组编辑，多种基于CRISPR/Cas9技术的细菌基因组编辑方法已被报道。这些方法的原理可以简单概括为：Cas9-sgRNA复合体特异性识别目标DNA并切割产生DNA双链断裂，随后断裂的DNA被修复系统所修复，在修复的过程中完成基因组编辑。然而，这些针对细菌的基因组编辑方法都依赖外源的同源重组系统或非同源末端连接系统来修复被Cas9蛋白切割的基因组DNA，这个限制到目前为止尚未被打破。产生这种依赖的原因是，大部分细菌內源的同源重组系统和非同源末端连接系统在修复DNA双链断裂时活性很弱，这一点与酵母等真核生物不同。

为了打破细菌基因组编辑所受到的这种限制，本发明提出了一种新的方法。使用严谨性强的诱导型启动子控制Cas9和sgRNA的表达，这样一来，只有当加入诱导剂时，CRISPR/Cas9系统才会启动，在此之前，细胞能够正常生长，而不会因为Cas9的切割而死亡。在诱导Cas9和sgRNA表达之前，通过一段时间的液体培养让细胞增殖，在这个过程中，细胞的数量和活性增加。加入诱导剂之后，CRISPR/Cas9系统启动并产生DNA双链断裂，随后细胞內源的DNA修复系统将断裂的DNA修复，实现基因组编辑。绝大部分的细胞因为DNA修复失败而死亡，但由于细胞的基数足够大，仍有大量的修复成功的细胞存活下来。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单高效的细菌基因组编辑方法，解除已有方法对外源修复系统的依赖，加快细菌代谢工程改造的进程。

按照本发明提供的技术方案，一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法，采用以下方法步骤：

1.构建一个以质粒为载体的基因组编辑系统，该系统由Cas9编码基因和sgRNA编码基因组成，Cas9编码基因和sgRNA编码基因由诱导型启动子控制。

2.将负载了基因组编辑系统的质粒转化至待编辑的宿主菌株中，得到的转化子在液体培养基中培养使细胞增殖。

3.待细胞增殖至指数期，加入诱导剂诱导Cas9蛋白和sgRNA表达。

4.诱导2–3小时后，将菌液以不同的稀释度涂在含有诱导剂的平板上。

5.从步骤4中的平板上挑取单菌落做PCR验证，获得正确的编辑菌株。

附图说明