[发明专利]核糖核酸酶的检测方法与试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种核糖核酸酶的检测方法与试剂盒及其应用。该检测方法是在待测核糖核酸酶和RNA酶抑制剂存在的条件下，在逆转录扩增体系中对RNA模板进行逆转录扩增，根据待测核糖核酸酶逆转录扩增Ct值确定待测核糖核酸酶的浓度。该方法可实现核糖核酸酶的高通量检测、无放射性污染、广谱性强、定量或相对定量检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种核糖核酸酶的检测方法与试剂盒及其应用。

背景技术

核糖核酸酶(Ribonuclesae，RNase)是一类催化RNA降解为小片段的核酸酶。RNase家族包括RNase A、RNase B、RNase C、RNase H、S-RNase、RNase P、RNase T等。其中，RNaseA是一种有广泛应用的核酸内切酶，RNase A在嘧啶核苷酸残基C和U的3’端处高效且专一地催化单链RNA链骨架上的磷酸二酯键的裂开，形成具有2’，3’-环磷酸衍生物的寡聚核苷酸。

核糖核酸酶是实验室普遍存在的环境污染物，对核糖核酸酶活性的监测是一个常规质量控制(QC)步骤，然而目前，核糖核酸酶活性检测的方法较少。主要包括放射性同位素法、分光光度法和荧光淬灭方法等等，然而上述方法难以实现高通量，同时需合成特定的寡聚核糖核酸分子作为作用底物，而且还需要设计合成特定带修饰的RNA探针，成本较高；或是易产生放射性污染，或是步骤多、周期长。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种核糖核酸酶非疾病诊断与治疗目的的检测方法，该方法可以实现高通量、模块化、快速检测核糖核酸酶的浓度。

本发明的第二目的在于提供一种核糖核酸酶检测试剂盒，该试剂盒可以快速高效检测出核糖核酸酶的浓度。

本发明的第三目的在于提供上述检测方法或试剂盒的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种核糖核酸酶非疾病诊断与治疗目的的检测方法，在待测核糖核酸酶和RNA酶抑制剂存在的条件下，在逆转录扩增体系中对RNA模板进行逆转录扩增，根据待测核糖核酸酶逆转录扩增Ct值确定待测核糖核酸酶的浓度。

进一步地，所述RNA模板中含有目的基因，所述逆转录扩增体系中包括检测目的基因的检测引物和检测探针。

进一步地，所述目的基因包括保守序列；

优选地，所述保守序列包括内参基因；

优选地，所述内参基因包括GAPDH、β-Actin、β-tubulin、18sRNA、28sRNA、SDHA或HPRT1。

进一步地，所述目的基因为GAPDH；

优选地，GAPDH的检测引物和检测探针包括：

上游检测引物：5’-TGGAGAAACCTGCCAAGTATGATA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游检测引物：5’-CAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3’(SEQ ID NO.2)；

检测探针：5’-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCAT-3’(SEQ ID NO.3)。

进一步地，所述逆转录扩增体系中包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液；

优选地，所述逆转录扩增体系中还包括镁离子、铵离子、钾离子和表面活性剂中的至少一种。

进一步地，所述核糖核酸酶包括RNase A、RNase B或RNase C。