[发明专利]一种效率高且成本低的无缝DNA组装方法

说明书

本发明对大肠杆菌DH10B进行工程改造，敲除基因组上的recB‑recC‑rec‑D基因并过表达基因组上的recE‑recT基因后得到性能优良的重组工程宿主菌株DH10B*，将1–3个带有20bp–40bp同源序列接头的DNA片段共转入该细胞即可体内组装成完整质粒，平板上形成的菌落阳性率高于95％。该方法与现有无缝DNA组装方法相比，省去了昂贵并且费时的体外连接操作，实现了高效率、低成本、低耗时的无缝DNA组装，在分子生物学实验中具有很大的应用价值。

技术领域

本发明涉及对大肠杆菌DH10B菌株的基因工程改造和对无缝DNA组装流程的优化，属于生物工程技术领域。

背景技术

DNA组装技术是分子生物学、代谢工程以及合成生物学中不可或缺的环节。传统的酶切连接方法由于受到酶切位点的限制现已逐渐被淘汰，无缝DNA组装技术的出现打破了酶切位点的限制，使得任意DNA片段的组装成为可能。无缝DNA组装与酶切连接的差别在于待连接的线性DNA片段末端带有同源序列，片段之间依靠同源序列的互补配对连接成环。近年来越来越多的无缝DNA组装方法被报道，相应的商用试剂盒也陆续被推出，如Gibson组装、In-Fusion组装等。然而，这些方法均需要将线性DNA片段进行体外连接后再转入宿主细胞，操作流程较为繁琐；另外，商用的试剂盒大都价格昂贵，比如：NEB公司推出的NEBuilder试剂盒平均每个连接反应的成为18.5美元。

为了降低无缝DNA组装的实验成本并简化其操作流程，本发明提出了一种基于体内重组进行DNA组装的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的重组工程宿主菌株DH10B*，无需进行体外连接，缩短了时长，简化了操作流程，而且大大降低了基因克隆的成本。

本发明的另一个目的是提供对质粒克隆的优化过程，进一步提高克隆效率。具体操作如下：

挑选合适的重组工程宿主菌株DH10B(或TOP10)

选择五个常用的质粒构建宿主菌株，DH5α、TOP10、DH10B、BL21、XL-1blue、Mach1-T1，分别制作化转感受态细胞，以pUC19质粒对其测感受态效率。通过PCR操作得到带有20bp同源末端区域的、含有氯霉素抗性的DNA片段2和含有p15A ori的片段3，两个片段的长度比约为1：1，故各取200ng转化到这六种菌的感受态细胞中，同时做三组平行实验以减小误差。在氯霉素抗性的平板上过夜培养后计算出平板上每种菌所对应的单菌落平均数，然后以感受态细胞转化效率×10⁵为单位计算CN/TE(即(菌落平均数×10⁵)/感受态细胞转化效率)，六种菌的CN/TE值相差很大，最高的为Top10与DH10B，最后在每个板上挑取单菌落进行菌落PCR验证，阳性率为100％。由于Top10与DH10B基因型一致，所以选择DH10B作为本次发明使用菌株。

对重组工程的条件优化(以下实验数据均由三组平行实验所得；每组实验所用感受态细胞均由pUC19质粒测定转化效率)

①为了验证过表达recET与敲除recBCD对质粒克隆效率的影响，我们做了一下以下实验：

在DNA片段接头长度为20bp，转化量为200ng的条件下，首先将含有氯霉素抗性的片段1分别转化DH10B、DH10B*(不加IPTG)和DH10B*(加0.8mM IPTG)这三种感受态细胞，得到pHCY-74A。这三者的CN/TE值分别为：51，105，526，表明recET的表达量直接影响克隆效率的高低；然后将长度比为1：1，含有氯霉素抗性的片段2和含有p15A ori的片段3分别转化DH10B、DH10B(敲除recBCD后,不加IPTG)、DH10B*(不加IPTG)三种感受态细胞，CN/TE值分别为：34，82，307。结果表明本发明中对DH10B的两步基因改造均为提高克隆效率的必要步骤。

②优化DNA片段的同源末端区域长度。