[发明专利]EGFR基因突变检测用组合物及检测方法

说明书

本发明公开一种高灵敏度的EGFR基因突变的检测用引物组合物及其检测方法。该引物组合物包括两条上游引物、探针和下游引物，其中第一条上游引物仅部分与靶序列互补配对，第二条上游引物及探针的序列分别与第一条上游引物上未与靶序列互补配对的部分序列相同。本发明的检测方法采用了数字PCR的方法，在进行常规数字PCR反应前对样本进行解链成单链的预处理。利用本发明的引物组合物及检测方法，可提高EGFR基因突变的检测灵敏度、特异性、降低检测成本；本发明的引物组合物及检测方法适用范围广、对样本中DNA含量要求极低。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，用于进行EGFR基因突变检测的数字PCR引物及其检测方法。更具体地，本发明涉及一种在核酸序列变异检测中提高检测灵敏度的数字PCR引物。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体而对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如基因克隆、实验动物表型鉴定、转录组研究、遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、亲子鉴定等等。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。上世纪90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR，qPCR)技术及相关产品更是将PCR发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术。

但是，在PCR扩增过程中影响其扩增效率的因素有很多，不能保证在反应过程中扩增效率保持不变和实际样品与标准样品以及不同样品之间的扩增效率是相同的，由此导致其定量分析所依赖的基础——循环阈值(Ct)不是恒定不变的。因此qPCR的定量只是“相对定量”，其准确度和重现性依然不能够满足分子生物学定量分析的要求。

长期以来，组织病理学诊断是肿瘤诊断的金标准和临床治疗的基础。然而对组织学类型、分期相同的肿瘤患者采取相同的治疗方案，往往只有一部分肿瘤患者有反应。据统计，传统医疗在肿瘤治疗上用药无效率高达75％。恶性肿瘤的疗效不好在于难以从组织诊断水平上对其恶性特征和药效特征进行判断。研究表明，肿瘤病变的分子特征决定了其恶性特征，转移特征，复发特征和耐药特征，是肿瘤愈后判断和对化疗药物反映的基本依据。因此，基于分子差异的个体化治疗是肿瘤精准治疗的方向，分子分型是实现个体化精准治疗的基础。

表皮生长因子受体EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)，是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。该EGFR基因位于7号染色体短臂7p12-14区，由28个外显子组成。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。EGFR的高表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的高表达。