[发明专利]一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用，是对大肠杆菌中的kdtA基因进行点突变形成，突变后的kdtA基因序列如SEQ ID NO:2所示。该重组菌株与未突变的野生型菌株相比，有利于生产高浓度的L‑苏氨酸，且菌株稳定性好，作为L‑苏氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，且是人和动物自身不能合成的氨基酸。L-苏氨酸可以强化谷物吸收，调节体内代谢平衡，促进机体生长发育，被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。

目前，L-苏氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-苏氨酸应用最广泛的方法。多种细菌可用于L-苏氨酸的微生物发酵生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-苏氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。但是仍然存在对开发以高产率更经济地生产L-苏氨酸的方法的需要。

发明内容

本发明的第一方面，提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的野生型kdtA基因编码序列第82位碱基发生突变而形成的序列。

根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明，所述突变为SEQ ID NO:1中第82位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；具体地，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二方面，提供如上所述的多核苷酸序列编码的重组蛋白。

根据本发明的重组蛋白，其包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明的第三方面，提供包括上述多核苷酸序列或重组蛋白的重组载体。

根据本发明的重组载体，是将上述多核苷酸序列导入质粒构建而成；作为一个实施方案，所述质粒为pKOV质粒。具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过内切酶进行酶切，形成互补的粘性末端，将二者连接构建成重组载体。

本发明的第四方面，提供一种重组菌株，其含有编码序列发生点突变的kdtA基因编码核苷酸序列。

根据本发明的重组菌株，其含有如第一方面所述的多核苷酸序列。

作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

根据本发明的重组菌株，是将上述重组载体导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株没有特别的限定，可以选自本领域已知的保留kdtA基因的产L-苏氨酸菌株，例如选自大肠杆菌中的至少一种。作为本发明的一个实施方案，所述宿主菌株为E.coli K12(W3110)菌株、E.coli CGMCC 7.232菌株。

根据本发明的重组菌株，是以pKOV质粒为载体。

根据本发明的重组菌株，其可以进一步包括或者不包括其他改造。

本发明的第五方面，还提供一种重组菌株的构建方法，包括如下步骤：