[发明专利]一种oppA基因改造的产L-色氨酸重组菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种oppA基因改造的产L‑色氨酸重组菌株及其构建方法与应用。本发明将大肠杆菌中野生型oppA基因中引入点突变，使SEQ ID NO:1的第817位碱基由腺嘧啶(A)突变为鸟嘌呤(G)所得到的核苷酸序列。本发明还提供一种重组菌株是将该多核苷酸序列导入产L‑色氨酸的大肠杆菌菌株中获得，重组菌株中包括含有点突变的oppA基因，与未经修饰的菌株相比具有更优异的产L‑色氨酸能力。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种oppA基因改造的产L-色氨酸重 组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新 陈代谢起着重要的作用，广泛应用于饲料行业中。

L-色氨酸的生产最早主要依靠蛋白质水解法和化学合成法，但是随着对微生物法生产L- 色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法又可分为直接 发酵法、微生物转化法和酶法，目前L-色氨酸生产主要以微生物发酵法生产为主。微生物发 酵法具有原料价格低廉、工艺控制简单、产品质量可靠等优点。但随着发酵工业的快速发展， 发酵法生产L-色氨酸对培养基营养成分和发酵调控的合理性提出了更高的要求。优良的L- 色氨酸生产菌株、合理的培养基组成和适当的发酵调控策略有利于提高L-色氨酸的产酸水平。

通过微生物生产L-色氨酸是从PEP(磷酸烯醇式丙酮酸(PhospoEnolPyruvate))与E4P(赤藓 糖-4-磷酸(Erythrose-4-Phosphate))的聚合产生的DAHP(3-脱氧D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸 (3-DeoxyD-arabino-heptulosonate-7-phosphate))起始的，PEP是糖酵解(glycolysis)的中间产物， E4P是磷酸戊糖途径的中间产物。然后，从分支酸(chorismate)经共同的芳香族生物合成途径 来生物合成L-色氨酸。目前，获得L-色氨酸高产菌株的方法主要包括诱变筛选育种或者基因 工程育种，如何有目的地获得L-色氨酸高产菌株将对于提高L-色氨酸产量有重大意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种重组菌株及其构建方法与应用。本发明的重组菌 株通过对于大肠杆菌中oppA基因开放阅读框编码区的核苷酸序列进行点突变，获得L-色氨 酸产量提高的重组菌株，与未改造的野生型菌株相比，重组菌株的产L-色氨酸能力更强。本 发明采用如下技术方案实现：

本发明的第一方面，提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括野生型oppA基因编 码序列第817位碱基发生突变而形成的核苷酸序列，所述野生型oppA基因编码序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述野生型oppA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱 变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1中第817位碱基由腺嘧啶(A)突变为鸟嘌呤 (G)；具体地，所述多核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供如上所述的多核苷酸序列编码的重组蛋白。

根据本发明的重组蛋白，其包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明的第三方面，提供包括上述多核苷酸序列的重组载体。

根据本发明的重组载体，是将上述多核苷酸序列导入质粒构建而成；作为一个实施方案， 所述质粒为pKOV质粒。具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过内切酶进行酶切， 形成互补的粘性末端，将二者连接构建成重组载体。

本发明的第四方面，提供一种大肠杆菌重组菌株，其含有如第一方面所述的多核苷酸序 列。