[发明专利]一种强启动子及其质粒载体和应用

说明书

本发明通过扩增黏着剑菌中的一种强启动子，进行生物信息学分析和功能验证，获得可广泛用于苜蓿中华根瘤菌、运动发酵单胞菌、新月柄杆菌、脱氮假单胞菌、致瘤农杆菌、流产布鲁氏菌、荧光假单胞菌、豆科根瘤菌和黏着剑菌等α‑变形菌门中基因表达、遗传基因操作和菌株改良的强启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明还涉及含有该强启动子的质粒载体，利用该启动子构建基因工程菌株的方法及相应的菌株，及宿主细胞在启动目的基因表达的应用。

技术领域：本发明属于生物技术领域，涉及一种强启动子，尤其涉及从黏着剑菌中分离、克隆得到的强启动子，还涉及包含该强启动子的质粒及含有该质粒载体的转化子，以及他们在异源或同源蛋白表达方面的应用。

背景技术：

启动子是基因的一个组成部分可以被RNA聚合酶识别，并起始启动子后面基因的转录，启动子启动强度的强弱对基因操作中外源基因的表达效率有着直接的影响。代谢工程常常需要表达外源基因或者调控内 源基因的表达，而启动子的选择对基因的表达调控至关重要。启动子影响基因的转录水平，影响人工合成途径或本源途径中各基因间协调性，继而影响菌株的代谢功能。

变形菌门是细菌中最大的一门，根据16sRNA可以分为五个纲，分别为α-变形菌、β-变形菌、γ-变形菌、δ-变形菌和ε-变形菌。其中α-变形菌中，包括很多动物和植物致病菌，如：流产布鲁氏菌、致瘤农杆菌等，以及很多可以产生具有一定功能次级代谢产物的菌种，如可以产生物乙醇的运动发酵单胞菌，可以产维生素B₁₂的脱氮假单胞菌、苜蓿中华根瘤菌和黏着剑菌等。为了进一步研究这些菌种的生理特征，以及扩大某一α-变形菌产次级代谢产物的能力，往往需要在菌体内过量表达一个或多个基因，这时就需要一个高效的启动子原件作为基础。然而，α-变形菌中可用的高效启动子数量非常有限。

发明人经过长期研究探索，发现了可以应用于多种α-变形菌的一种强启动子。

发明内容：

本发明的目的在于：提供一个强启动子，包含该强启动子的质粒载体及其应用。本发明以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌)为模板，扩增获得了一个强启动子序列，以绿色荧光蛋白为报告基因，对该启动子进行了评价。这个强启动子还可以应用于黏着剑菌外的其他多种α-变形菌门菌种中。该发明扩展了α-变形菌门的启动子元件，对于α-变形菌门菌种中的基因表达、遗传基因操作和菌株改良有重要意义。

第一方面，本发明提供了一种强启动子，其核苷酸序列任选自如下(a)、(b)或(c)所述的序列：

(a)强启动子为序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(b)与序列表SEQ ID NO:1具有75％以上一致性，且具有启动子功能的核苷酸序列；

(c)在高严谨条件下与(a)或(b)所述的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核苷酸序列。

优选地，所述(b)为与序列表SEQ ID NO:1具有95％以上同源性，且具有启动子功能的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供了一种含有强启动子的质粒载体，所述质粒载体为游离型或整合型载体。优选地，所述游离型载体为含有革兰氏阴性菌均可识别的复制子和mob基因的广泛宿主穿梭质粒载体，进一步优选pBBR1MCS2；所述整合型载体为携带有靶基因翼侧500-4000 碱基同源重组臂的同源重组载体，进一步优选pUC系列质粒。

所述质粒载体还包括编码目的多肽的核酸序列。所述编码目的多肽的核酸序列包括荧光蛋白；优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。