[发明专利]一株基于大肠杆菌改造的工程菌株

说明书

MG1655是具有明显生长优势的野生型大肠杆菌菌株，本发明提供了一株基于MG1655改造的工程菌株，该菌株同时具备生长速度快和转化潜能高的优点，为质粒克隆提供了新的宿主，为代谢工程提供了新的底盘细胞。

技术领域

本发明涉及一株基于大肠杆菌MG1655改造的工程菌株，属于生物工程技术领域。

背景技术

工程菌株是用基因工程的方法，对出发菌株进行改造后得到的菌类细胞株系，具有多功能、高效和适应性强等特点。大肠杆菌作为原核生物的模式生物，由其改造而来的工程菌株在合成生物学、代谢工程和基因工程中具有广泛的应用。例如：DH5α等工程菌株可以作为质粒克隆的宿主细胞，BL21(DE3)等工程菌株可以作为蛋白表达的宿主细胞。

目前市面上有很多适用于质粒克隆的工程菌株，如DH5α，TOP10，DH10B，BL21，Mach1-T1，XL10-gold，XL1-blue等。然而，这些工程菌株与野生型大肠杆菌菌株相比通常生长缓慢且抗逆性差，以这些工程菌株作为质粒克隆的宿主细胞会导致实验周期延长。

以MG1655等野生型大肠杆菌菌株为出发菌株，利用新型的精确无痕的基因组编辑技术敲除其对外源DNA的防御系统等相关基因，可以在保留其生长速度快和抗逆性强等优势的同时提高转化潜能，为质粒克隆提供一种更优的宿主细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一株生长速度快、抗逆性强的适用于质粒克隆的菌株，该菌株是在大肠杆菌MG1655菌株的基础上利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行五次迭代编辑获得，具有转化效率高且生长速度快等优点，为质粒克隆提供新的宿主选择。

本发明提供的一株基于MG1655改造的工程菌株，与出发菌株相比其新增的基因型为：Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)，mcrA-，endA，recA，Δ(araD-araA-araB)::tet^R。对这些基因型的详细介绍如下：

mcrCB-hsdSMR-mrr和mcrA组成大肠杆菌的限制系统，其产生的限制性内切酶可以特异性切割外源DNA，促进外源DNA被细胞内的其他核酸酶进一步降解，敲除大肠杆菌的限制系统可以减轻对外源DNA的防御，有利于环状DNA或线性DNA在细胞内的稳定存在。

endA表达DNA特异性核酸内切酶I，该内切酶位于细胞壁膜间隙(周质)中，可将双链DNA中裂解成约7bp的寡核苷酸，是细胞抵御外源DNA的“守门神”，敲除该基因有利于环状DNA或线性DNA穿过细胞膜进入细胞。

recA表达DNA重组蛋白RecA，RecA可催化DNA进行同源重组，也可作为调节蛋白诱导细胞应激反应，不利于外源DNA在细胞中的稳定存在，敲除该基因可以提高外源DNA在细胞内的稳定性。

由L-阿拉伯糖诱导的P_BAD启动子是大肠杆菌中常用的诱导型启动子，使用P_BAD启动子时往往需要加入高浓度的L-阿拉伯糖诱导，araD-araA-araB是L-阿拉伯糖降解基因，敲除araD-araA-araB可以阻断大肠杆菌对L-阿拉伯糖的降解，有效地增强了L-阿拉伯糖的诱导强度并延长了其诱导时间。

四环素是一种广谱抗菌素，tet^R是四环素抗性基因，在基因组上插入该基因使其获得对四环素的抗性，可以有效避免该菌株被环境中的杂菌污染。

测定改造前后菌株的生长曲线。

测定改造前后菌株的转化效率。

优化条件(感受态制作方法及转化方法)以提高改造后菌株化转效率。

测定改造后菌株在不同抗性板上的生长速率。

附图说明

图1为MG1655与目前常见菌株的生长曲线对比；