[发明专利]一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法

说明书

本发明提出了一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，将微塑料悬浮液浓缩、过滤后加入偶联剂反应，染色，采用流式细胞仪计数并分选；所述染色剂为藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液。本发明将染色剂藻蓝蛋白或藻红蛋白和其他染色剂进行复配，两者可以进行一定程度的结合，具有增强荧光显色度的效果，增强了其应用性。

技术领域

本发明涉及污染除了技术领域，具体涉及一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法。

背景技术

微塑料是海洋塑料垃圾中的一个重要类型，目前一般是指尺寸小于5mm的塑料，包括通过各种途径进入海洋的塑料工业使用的米粒大小的塑料颗粒原料( nurdles) 、大块塑料垃圾在海洋中经理化作用（海浪冲击、水解和光降解等）形成的塑料碎屑等、各种生活用品的添加物( 例如卫生用品、美容用品等) 和工业生产使用的抛光料等。为了从不同的海洋环境中鉴别和定量分析微型塑料，研究人员采取了许多不同的采样、测定和分析方法。传统水体采样预处理后一般将微塑料过滤到各类膜上，在显微镜下进行样品计数并用尖镊挑选样品，再用各类方法进行鉴定。实际操作过程中，不仅显微镜下人工计数环节费时费力，针对小于100um微塑料颗粒的挑选也非常困难，造成实际工作中小尺寸微塑料颗粒丰度计算及鉴定的极大误差。

流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的特异性荧光信号及非荧光散射信号的将细胞亚群从中分选出来。根据流式细胞仪的工作原理，我们可以将微塑料染上荧光染料后，比如尼罗红染料，用流式细胞仪对微塑料100um以下的颗粒进行自动计数和分选。

发明内容

本发明提供一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，通过将染色剂藻蓝蛋白或藻红蛋白或/和其他染色剂进行复配，得到一种荧光性强的标记方法，复配时两者可以进行一定程度的结合，具有增强荧光显色度的效果，增强了其应用性。

本发明提供一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，将微塑料悬浮液浓缩、过滤后加入偶联剂反应，染色，采用流式细胞仪计数并分选；所述染色剂为藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液。

作为本发明进一步的改进，所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液中藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白的质量分数为0.5-1wt%。

作为本发明进一步的改进，具体包括以下步骤：

S1. 样品制备：对微塑料悬浊液样品进行浓缩，用细胞滤膜过滤除去100μm以上不便于利用流式细胞仪的较大尺寸颗粒物，加入偶联剂，反应1-2h；配置藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液，加入经前步处理的微塑料悬浊液中对微塑料颗粒进行染色；

S2. 流式细胞仪检测：开机预热并例行检查后，排除管路中气泡；检测阴性对照除去空白，检测单阳管，根据仪器或实验要求选择适合流速，按设置顺序上样获取数据，数据分析。

作为本发明进一步的改进，所述染色条件为采用超声波震荡仪将混合液震荡混匀后静置10min，离心，弃除上清液；所述超声波震荡仪的功率为1000-1200W；所述离心条件为离心转速为10000-15000r/min，离心时间为10-20min。

作为本发明进一步的改进，所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液与微塑料悬浊液的体积比为1：（80-120）。

作为本发明进一步的改进，所述微塑料悬浊液的密度为2.2-2.7g/cm³，采用悬浮法密度计测定。

作为本发明进一步的改进，所述偶联剂为硅烷偶联剂，添加后溶液偶联剂的质量分数为0.1-0.2wt%。

作为本发明进一步的改进，所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液由藻蓝蛋白或藻红蛋白与其他染色剂的复合物溶液替换，所述藻蓝蛋白或藻红蛋白与其他染色剂的复合物溶液由以下方法制备：将其他染色剂配置成溶液，与藻蓝蛋白或藻红蛋白溶液等体积混合。