[发明专利]暗色刺参的荧光PCR检测方法及其引物和探针

说明书

本发明涉及暗色刺参的实时荧光PCR检测方法。基于具有高度物种特异性的暗色刺参线粒体细胞色素氧化酶亚基I(Cytochrome oxidase subunit I，COI)序列(GenBank:AF486424.1)设计了具有物种特异性的引物和探针，实现以Real‑Time PCR的方法对暗色刺参进行物种成分检测和鉴定。本方法由于其引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，可用于深加工及多种海参混合制品中暗色刺参的真伪鉴别。

技术领域

本发明涉及暗色刺参的实时荧光PCR检测方法。使用TaqMan探针实时荧光PCR检测技术，对暗色刺参进行物种成分检测鉴定，属于生物技术领域。

背景技术

海参不仅是珍贵的食品，也是名贵的药材，在中国等亚洲国家深受消费者喜爱。全球有海参1400余种，分别属于6个目，25个科，可供食用的海参约40多种。

暗色刺参(Isostichopus fuscus)属于棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothuroidea)、楯手目(Aspidochirotida)、刺参科(Stichopodidae)动物。产于厄瓜多尔，是刺参中的珍品，也是目前海参纲中唯一列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)目录的物种。即便如此，受到经济利益驱使，市场上暗色刺参的销售也并未绝迹。随着海参的食用和药用价值得到了越来越广泛的认可，以及电子商务的涌现，国内市场上也涌现出许多国外的海参种类，其中不乏暗色刺参身影。

对濒危动植物的精准鉴别是对濒危物种开展保护的最基本手段。传统的海参鉴别方法主要依赖海参的外部形态和解剖特征，如骨片特征和呼吸树的有无等等，但这往往需要鉴定人员丰富的经验。海参销售时，往往已经被加工成干海参、盐渍海参、即食海参、冻干海参、海参胶囊及海参口服液等，形态已经不完整，单纯从形态上也比较难鉴别。现代分子生物学的鉴别方法可有效克服上述形态学鉴定方法的不足，同时也比物理学的光谱结构分析法，及化学的内含物质结构分析法更加稳定可靠。因此建立起分子鉴定方法，实现暗色刺参的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种用于检测暗色刺参的引物和探针，可用于海参制品真伪鉴别。引物探针序列如表1所示。

表1 Real-Time PCR的引物和探针

F：上游引物；R：下游引物；P：探针；

*引用自GB/T25165-2010。该引物探针可作为内参照引物探针，检验所抽提DNA的质量；

—：表示省略，详见国家标准GB/T25165-2010.

进一步的，所述引物和探针的使用浓度比为：IF-F:IF-R:IF-P＝1:1:1

本发明还提供了一种检测暗色刺参的PCR鉴定方法，包括如下步骤：

(1)样本的处理；

(2)提取经(1)处理后的木材样本中的DNA；

(3)利用引物IF-F和IF-R，以及探针IF-P对(2)中提取的DNA进行荧光PCR扩增；

(4)种类的确定；

所述引物和探针序列包括：

IF-F:AAAATGCGAACCCCAGGAG

IF-R:TCCCAAACCCAGGAAGAATTAGA

IF-P：FAM-TTTTTGACCCAGCTGGAGGA-Eclipse。

进一步的，所述引物和探针还包括内参照引物和探针，其序列分别是：