[发明专利]一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的分离鉴定和筛选方法

说明书

本发明公开了一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的分离鉴定和筛选方法，属于生物技术领域。本发明的目的是从奶牛粪便中高效的分离并筛选出耐受性好、生长优势佳的酿酒酵母菌，以及其中的分离鉴定和筛选方法。本发明的有益效果是：利用生物学和分子生物学鉴定成功的从奶牛粪便中分离纯化出酿酒酵母菌，并通过耐酸筛选、耐胆碱筛选、耐组胺筛选、耐内毒素筛选、耐高温筛选、菌株活性比较筛选和生长曲线实验，成功的筛选出了一株耐受性高，生长优势佳的酿酒酵母菌。用于优质的酿酒酵母菌微生态制剂的制备，对研发反刍动物微生体制剂提供优质菌种，推动反刍动物生物制品的研发起着至关重要的作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的分离鉴定和筛选方法。

背景技术

益生菌是一类可对动物机体产生有益效果的活性微生物，主要定植于动物机体的肠道内，益生菌可改善动物机体菌群平衡，促进动物机体健康。酿酒酵母菌是酵母菌中应用最广泛的益生菌，其对胃壁有较强的粘附性且其在复杂的胃肠道环境中具有高存活力。其益生作用主要体现在可抵抗炎症反应、提高机体免疫力，维持机体代谢平衡等。所以优质的酿酒酵母菌的分离鉴定及筛选，可为人类健康和畜牧养殖业的发展做出重大贡献。

酿酒酵母菌的分离来源广泛，在酒糟、葡萄、胃肠道内容物等均可分离出。目前，酿酒酵母菌的分离鉴定方法有多种，其中生物学鉴定能从形态学的角度达到鉴定作用，分子生物学可从基因的角度更精准的鉴定。然而，对于从奶牛粪便中酿酒酵母菌的快速分离鉴定方法还未有效设计。所以，合理的利用并设计酿酒酵母菌的鉴定方法，有利于快速准确的鉴定出优质的酿酒酵母菌。

耐酸和耐胆碱筛选方法是益生菌的常用筛选方法。但是当动物机体发生疾病时，胃肠道的环境将会变的十分复杂，例如可使致病菌释放的内毒素增多，促进肥大细胞中组胺的释放，使动物机体体温升高等，这些因素将会严重影响益生菌的定植从而影响其发挥益生功能。所以为抵抗复杂的微生态环境，需健全更为有效的筛选方法。优质酿酒酵母菌的筛选，是当前微生态制剂制备必须发掘的技术方法。尤其当畜禽患病时，需筛选出可抵抗肠道复杂的微生态环境并且存活率高，生长优势佳的酿酒酵母菌，从而有助于酿酒酵母菌发挥益生功能。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的分离鉴定和筛选方法，能够从奶牛粪便中高效、准确、快速的分离和筛选出优质的酿酒酵母菌。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于奶牛粪便中酿酒酵母菌的分离方法，包括以下所需成分：酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、WL固体培养基、赖氨酸固体培养基；

分离方法为：

a.样本采集：选取健康奶牛的新鲜粪便20g，置于含有100mL无菌的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，并充分混匀；

b.样本扩大培养：将含有粪便的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基放入摇床中，在温度为28℃且转速为180rmp/min中过夜培养；

c.样本分离：将过夜培养的样本用3层纱布过滤，转移至另一个空的无菌锥形瓶中，然后将样本稀释，稀释梯度分别为10¹、10²、10³、10⁴，取10³、10⁴稀释后的样本100μL，均匀涂布接种于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上，在30℃恒温培养箱中培养48-72h；

d.样本纯化：将酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上的酵母菌菌落挑选出，并划线接种于另一个无菌的酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基中，在30℃恒温培养箱中培养48-72h，再重复以上操作，直到得到酿酒酵母菌的单克隆菌落。