[发明专利]一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒

说明书

本发明涉及一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒，所述试剂盒包括同步检测3种病原(WSSV、EHP和SHIV)的引物。本发明基于定量PCR检测方法，不仅检测灵敏度比普通检测方法大幅提升，还可以实现同步评估3种病原的感染率与感染程度，适用于对对虾中3种病原隐性感染的早期监测，尤其适用于对取样量和带毒量双低的虾苗样品的批量检测。

技术领域

本发明属于虾类病原检测领域，特别涉及一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒。

背景技术

引进品种凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)因为生长速度快、适应性强，其种苗培育和养殖产业在我国得到持续发展，成为我国重要水产养殖经济品种。然而，随着混养与集约化等多种模式的开发和国内外虾类产品与苗种流通的增加，我国凡纳滨对虾病原种类呈现增多趋势，如白斑综合征病毒(WSSV)、虾肝肠胞虫(EHP)和虾虹彩病毒(SHIV)等。其中，WSSV等多种病毒所致疾病被农业农村部列入需要重点防控的动物疫病名录；EHP和SHIV尽管为近年新发病原，但是造成的经济损失却非常严重，已经成为虾类养殖业的重要威胁。鉴于对虾病原种类的多样性、危害严重性以及许多养殖病害的暴发源于病原对种苗的微量感染等，近年来生物安保育苗技术在大型对虾育苗场逐步推广，通过对苗场生物性危害因素和关键控制点的监测、识别与防控，确保苗种的无毒化培育。近几年在上海、海南和福建等省市几家大型凡纳滨对虾育苗场对常见病原的检测结果表明，EHP、WSSV和SHIV为育苗场内主要生物性危害因素，因此，这3种病原为凡纳滨对虾育苗场内构建生物安保体系的重点监测对象。

常规的病原检测技术如组织病理、免疫组化等具有周期长、取样量大、不能一次确诊等缺点，而大型苗场的样品还具有批次多、检测量大且取样量和携带病原量均低的特征，因此，快速、灵敏和组织样品需要量极小的聚合酶链式反应(PCR)技术适用于对苗种病原的检测，尤其是灵敏度高的多重或同步定量PCR检测技术，既能满足监测中对灵敏度和风险程度准确评估的要求，又能适应对检测的快速、通量化需要，可以为苗场生物安保技术体系的构建和对虾健康养殖提供良好技术支撑。目前，还未见一种针对这三种病原可以做到同步定量检测的试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒，该试剂盒基于定量PCR检测方法，不仅检测灵敏度比普通检测方法大幅提升，还可以实现同步评估3种病原的感染率与感染程度，适用于对对虾中3种病原隐性感染的早期监测，尤其适用于对取样量和带毒量双低的虾苗样品的批量检测。

本发明提供了一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：

EHP上游：5'-GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGT-3'；

EHP下游：5'-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3'；

WSSV上游：5'-CGACAGACTACTAACTTCAGCCTAT-3'；

WSSV下游：5'-AAGAGGATACCAGATGCTCGTT-3'；

SHIV上游：5'-CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT-3'；

SHIV下游：5'-GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG-3'。

所述3种重要虾类病原为白斑综合征病毒(WSSV)、虾虹彩病毒(SHIV)和虾肝肠胞虫(EHP)。

所述试剂盒(20μL)的组分为：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL，上游引物(10μM)0.6μL，下游引物(10μM)0.6μL，DNA模板2μL，无DNA酶水6.8μL。

所述试剂盒的反应程序为：95℃30s预变性；然后95℃5s，60℃20s，循环40次。