[发明专利]马克斯克鲁维酵母醛酮还原酶KmAKR突变体及其应用

权利要求书

1.一种马克斯克鲁维酵母醛酮还原酶KmAKR突变体，其特征在于所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第63位点进行定点饱和突变获得的，所述突变体为下列之一：(1)第63位苏氨酸突变为丙氨酸；(2)第63位苏氨酸突变为亮氨酸；(3)第63位苏氨酸突变为蛋氨酸。

2.一种权利要求1所述醛酮还原酶KmAKR突变体在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用，其特征在于所述应用方法为：将含醛酮还原酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体或混合菌体提取的粗酶液为催化剂，以羰基化合物为底物，以葡萄糖为辅底物，采用pH7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-35℃、400～600rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得手性醇化合物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述转化体系中，底物终浓度30～450g/L，葡萄糖终浓度30～450g/L，催化剂用量以混合菌体总量干重计为0.1～20g DCW/L，所述混合菌体中含醛酮还原酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体与含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体以干重比1.0～5.0:1。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述羰基化合物为下列之一：4-氯-3-羰基丁酸乙酯、6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、3-羰基丁酸乙酯、4-溴-3-羰基丁酸丙酯、4,4,4,-三氟-3-羰基丁酸乙酯、6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、3-羰基丁酸叔丁酯、苯乙酮。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于当底物为6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时，所述应用方法为：将含醛酮还原酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、400～600rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于当底物为6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时，所述应用方法为：将含醛酮还原酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、400～600rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将携带醛酮还原酶突变体基因的大肠杆菌工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度1.5％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含醛酮还原酶突变体的湿菌体；所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体制备方法同含醛酮还原酶基因的湿菌体。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述粗酶液按如下方法制备：按照湿菌体总量100g/L的量加入pH 7.0、100mM PBS缓冲液中，在冰水混合物上超声破碎6min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s、暂停1s，取破碎混合液，获得粗酶液。