[发明专利]一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体、表达系统及其制备方法、应用

说明书

本发明涉及一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体、表达系统及其制备方法、应用，属于生物技术领域。本发明中的遍在染色质开放表达元件(UCOE序列)是在分析人UCOE序列(GenBank accession no.D28877.1)的基础上，删除了HNRPA2B1启动子序列，形成672bp序列，并发现672bp序列存在隐蔽拼接位点，将455、493隐蔽拼接位点进行突变设计合成了一种新型的UCOE元件。与天然UCOE序列相比，本发明的UCOE序列在提高哺乳动物细胞转基因表达水平上效果更为显著。

技术领域

本发明涉及一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体、表达系统及其制备方法、应用，属于生物技术领域。

背景技术

随着基因工程技术的发展，利用基因工程生产的重组蛋白质类的数量和种类不断的增加，并已经成为医药工业的重要部分。哺乳动物细胞由于具备类似于人类细胞的翻译后加工修饰(post-translational modifications，PTMs)的功能，因此，哺乳动物细胞表达系统是目前药物重组蛋白生产的重要平台。中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞表达系统和HEK293细胞是目前应用最为广泛的一类动物细胞表达系统，其中近70％批准上市的重组药物蛋白、重组抗体是采用CHO细胞和HEK293细胞生产的。但是哺乳动物细胞表达系统存在重组蛋白表达水平低、高产稳定细胞筛选周期长、细胞培养成本高等缺陷，严重制约着重组蛋白药物的生产。而影响重组蛋白在哺乳动物细胞中表达的因素复杂，表达载体就是其中一个重要因素。

遍在染色质开放元件(Ubiquitously-acting chromatin opening element,UCOE)是具有组织非特异性显性染色质重塑功能的DNA结构域，能使DNA不依赖于染色体插入位点，处于转录活性的“开放”状态。第一个UCOE是在TATA结合蛋白-蛋白酶体亚单位C5编码蛋白(TATA-binding protein-proteasomal subunit C5-encoding protein,TBP-PSMB1)基因的染色体位点中被鉴定的，随后在异质核糖核蛋白A2/B1-异染色质蛋白1Hs-γ(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1-heterochromatin protein 1Hs-gamma,HNRPA2B1-CX3)也发现了UCOE序列。自从UCOE发现以来，已经得到了广泛应用，研究证实在表达载体的启动子之前插入UCOE可以显著提高转基因转录的水平和稳定性，并且有效地保护启动子免受表观遗传沉默。HNRPA2B1-CX3序列为2.6kb无甲基化的CpG片段，另外1.5kb、4.0kb、8.0kb不同大小的UCOE片段都能提高CHO细胞中目的蛋白表达(Neville J J,Orlando J,Mann K,McCloskey B,Antoniou M N.2017.Ubiquitous Chromatin-openingElements(UCOEs):Applications in biomanufacturing and gene therapy.BiotechnolAdv,35:557～564)。

公布号为CN 101260384A的中国发明专利申请公开了具有遍在染色质开放表达元件(UCOE)的聚核苷酸；公布号为CN104531699A的中国发明专利申请公开了一种增强外源基因表达的猪的UCOE调控元件片段。但两项公开的中国发明专利申请中UCOE序列来源于天然的UCOE序列，缺乏对有功能UCOE序列的特征分析，另一方面常用的UCOE元件较大，增加了载体构建难度，另外质粒的转染效率会随着载体的大小的增加而降低，从而限制了UCOE元件在哺乳动物细胞表达系统中的应用。此外，由于缺乏对有功能UCOE序列的分析，导致UCOE元件中没有功能或者有副作用的元件存在，导致UCOE的功能减弱或者增强作用被抵消。

发明内容

本发明的目的是提供一种遍在染色质开放表达元件，该序列可增强哺乳动物表达系统转基因的表达，实现重组蛋白在宿主细胞的高表达。