[发明专利]一种固定液和固定细胞的方法与应用

说明书

本发明涉及免疫荧光技术领域，尤其涉及一种固定液和固定细胞的方法与应用。本发明公开了一种固定液，A液为体积分数为90％冷甲醇，B液为体积分数为1％多聚甲醛。该固定液有利于细胞爬片，细胞不容易脱落，免疫组化时细胞数量多，该固定液多聚甲醛的用量少，还可以防止抗原丢失，维持细胞正常结构以及尽量使抗原保持能与抗体结合的状态，从而使得免疫荧光检测时荧光效应显著，荧光图像美观准确。另外，该固定液相对于其他固定液经济易得，且不存在易燃易爆的危险，在室温下即可操作，不要求特殊的实验环境。

技术领域

本发明涉及免疫荧光技术领域，尤其涉及一种固定液和固定细胞的方法与应用。

背景技术

进行免疫荧光分析的预处理是将组织细胞固定。免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断，因此固定液的选择至关重要，决定了能否得到准确可用的免疫荧光分析结果。

多聚甲醛固定蛋白质比用有机溶剂能更好地保持细胞结构，4％多聚甲醛固定液，温和，穿透力强，固定效果好，因而在实验室中较常使用。但4％多聚甲醛固定的细胞免疫荧光检测时出现的荧光效应还有待提高。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种固定液和固定细胞的方法与应用，该固定液固定的细胞在免疫荧光检测的荧光效应高。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种固定液，

所述固定液由A液和B液组成；所述A液为体积分数为90％冷甲醇，B液为体积分数为1％多聚甲醛。

本发明中，冷甲醇的温度为-20℃。

本发明中，多聚甲醛固定蛋白质比用有机溶剂能更好地保持细胞结构，但可能降低某些细胞组分的抗原性，一般需要进行抗原修复。经多聚甲醛固定后，与胞内自由氨基结合的抗体也许不再识别这些抗原，这会导致免疫荧光检测时无法出现荧光效应。且多聚甲醛的固定是不稳定的，标本经多聚甲醛固定后应再经去污剂处理，如果标本在水溶液中浸泡的时间过长，则会使交联结构解体。而本发明固定液多聚甲醛的用量少，可以防止抗原丢失，维持细胞正常结构以及尽量使抗原保持能与抗体结合的状态，从而使得免疫荧光检测时荧光效应显著。

本发明还提供了一种固定液固定细胞的方法，向细胞中加入固定液中的冷甲醇进行固定；

所述固定后，弃掉所述孔中的冷甲醇，再使用所述固定液中的多聚甲醛进行固定。

本发明中，所述细胞优选培养在六孔板中，冷甲醇和多聚甲醇分别向每个孔中加入。

优选地，所述甲醇与所述多聚甲醛的用量比为1：1～3：1，更优选为1：1。

优选地，所述冷甲醛的固定时间为15min～25min，更优选为15min。

优选地，所述多聚甲醛的固定时间为10min～15min，更优选为15min。

优选地，所述多聚甲醛进行固定后，还包括：弃去固定后的多聚甲醛。

优选地，所述弃去固定后的多聚甲醛后，还包括：每孔加入PBS清洗。

本发明中，所述清洗的次数优选为5次，每次优选5min。

优选地，所述细胞为3T3、HaCat或hiPSC。

本发明还提供了一种免疫荧光染色试剂盒，包括：上述固定液。

本发明免疫荧光染色试剂盒封闭液、心肌细胞的单克隆抗体和荧光标记的羊抗鼠IgG。