[发明专利]一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法

说明书

本发明涉及一种基于G‑四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，属于生化分析领域。首先，以含G‑四链体序列、经不同甲基化修饰的Hairpin DNA为底物，加入BstUI，于60℃反应，含BstUI甲基化敏感位点的Hairpin DNA底物不能被识别，从而不能被剪切，而不含BstUI甲基化敏感位点的Hairpin DNA底物能被剪切，释放出G‑四链体片段；最后，向体系中加入N‑甲基卟啉二丙酸IX，与G‑四链体结合产生强荧光信号，可根据荧光信号的强弱鉴别BstUI的甲基化敏感位点。此外，也可通过凝胶电泳对反应后的DNA进行表征以判断甲基化敏感位点。本方法提供了两种灵活的鉴别方式，并鉴别了新的BstUI的甲基化敏感位点。

技术领域

本发明涉及一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，属于生化分析领域。

背景技术

限制性内切酶，又称限制酶，是可以识别特定的脱氧核苷酸序列，并对在每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。限制作用实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。大多数限制酶对DNA甲基化敏感，当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切反应会产生影响。因此，为有效的切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。

BstuI是一种商品化的限制性内切酶，被广泛应用于DNA甲基化的相关研究中。目前BstUI的甲基化敏感信息文献报道较模糊，仅指明其为CpG甲基化敏感的限制性内切酶，但具体甲基化敏感位点并不清楚。REBASE是一个非常有用的资源库，可查询限制性内切酶全面信息及更新信息，包括限制性内切酶的特异性、灵敏度和商业化来源等。REBASE中提供的BstUI的识别序列以及甲基化敏感相关信息如图1所示。

本发明旨在建立一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，通过合理设计底物DNA序列，以聚丙烯酰氨凝胶电泳或以N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)与G-四链体结合产生的强荧光为信号源，实现对BstUI的甲基化敏感位点的鉴别，为现有资料提供补充。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法。首先，以含有G-四链体序列、经不同甲基化修饰的Hairpin DNA为底物，加入对甲基化敏感的限制性内切酶BstUI，于60℃条件下进行剪切反应，含有BstUI甲基化敏感位点的HairpinDNA底物不能被BstUI识别，从而不能被剪切，而不含BstUI甲基化敏感位点的Hairpin DNA底物能被剪切，从而可释放出G-四链体片段；最后，向体系中加入N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)，其与G-四链体结合后，产生强荧光信号，可根据荧光信号的强弱鉴别BstUI的甲基化敏感位点。此外，也可同时通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对剪切反应后的DNA进行表征以判断甲基化敏感位点。本方法提供了两种灵活的鉴别方式，并鉴别了新的BstUI的甲基化敏感位点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，包括以下步骤：

(1)将含有G-四链体序列的底物DNA(经不同甲基化修饰)溶于TE缓冲液(10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)中，配制成100μM的底物DNA，于水浴中加热至90℃，保持5min，缓慢冷却至室温，得到100μM的Hairpin DNA底物。

(2)将2μL 100μM的Hairpin DNA底物加到100μL 1×CutSmart缓冲液(50mMPotassium Acetate,20mM Tris-acetate,10mM Magnesium Acetate,100μg/ml BSA,pH7.9)，加入3μL 1000U/mL BstuI，以，于60℃水浴中进行BstUI催化的剪切反应，反应时间2h。