[发明专利]PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法在审
| 申请号： | 201910938616.6 | 申请日： | 2019-09-30 |
| 公开（公告）号： | CN110592140A | 公开（公告）日： | 2019-12-20 |
| 发明（设计）人： | 王清路 | 申请（专利权）人： | 王清路;许晓松 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/90;C12N9/22;C12N15/66 |
| 代理公司： | 37280 淄博启智达知识产权代理事务所(特殊普通合伙) | 代理人： | 任永哲 |
| 地址： | 255086 山东省淄*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 构建 基因缺陷型 慢病毒 分子生物学技术 慢病毒质粒 靶向识别 胞外蛋白 嵌合序列 细胞制剂 信号引导 肿瘤免疫 肿瘤细胞 靶向 基序 制法 转染 突变 蛋白 细胞 参考 开发 | ||
1.一种PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于包括以下步骤：
(1)PD-1-CAR嵌合序列构建
人工合成PD-1-CAR嵌合序列，并在全序列5’端ATG前添加EcoRI位点，3’端TGA终止密码子后添加Spel位点，然后克隆进pMD18-T载体，得到pMD18-T-CAR载体；
PD-1-CAR嵌合序列为SEQ ID NO.1；
(2)PD-1-CAR慢病毒构建
基于pMD18-T-CAR载体构建pSin-EF2-Pur-CAR载体，然后将pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G质粒混匀后转染293T细胞，制备PD-1-CAR慢病毒；
(3)PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞的构建
将PD-1-CAR慢病毒转染PD-1基因缺陷型T淋巴细胞，转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR载体的制备方法是采用EcoRI和Spel双酶切pMD18-T-CAR和pSin-EF2-Sox2-Pur两个质粒，回收PD-1-CAR序列和线性化的pSin-EF2-Sox2-Pur，连接构建pSin-EF2-Pur-CAR载体。
3.根据权利要求1所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G的质量比为15-25：12-18：5-8。
4.根据权利要求3所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G的质量比为20：15：6。
5.根据权利要求1所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤(2)中所述的转染时间为45-50h。
6.根据权利要求5所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤(2)中所述的转染时间为48h。
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