[发明专利]以失活的筛选剂抗性基因为报告体系的C·T碱基替换的细胞富集技术及其应用有效
| 申请号： | 201910938668.3 | 申请日： | 2019-09-30 |
| 公开（公告）号： | CN110628794B | 公开（公告）日： | 2021-07-16 |
| 发明（设计）人： | 徐雯;杨进孝;张成伟;赵思;冯峰 | 申请（专利权）人： | 北京市农林科学院 |
| 主分类号： | C12N15/65 | 分类号： | C12N15/65;C12N15/66;C12N15/82;C12N9/22 |
| 代理公司： | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人： | 关畅 |
| 地址： | 100097 北京市海淀区曙*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 筛选 抗性 基因 报告 体系 碱基 替换 细胞 富集 技术 及其 应用 | ||
1.成套试剂，其包括sgRNA或与所述sgRNA相关的生物材料、C·T碱基替换系统和功能丧失的筛选剂抗性基因或与所述功能丧失的筛选剂抗性基因相关的生物材料；
所述sgRNA由靶向目标基因靶点序列的sgRNA和靶向所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的sgRNA组成；
所述sgRNA结构如下：所述靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架；
所述C·T碱基替换系统包括Cas9核酸酶或与所述Cas9核酸酶相关的生物材料和胞嘧啶脱氨酶或与所述胞嘧啶脱氨酶相关的生物材料；
所述C·T碱基替换系统在靶向所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的sgRNA的向导下，可通过对所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列进行C·T碱基替换使所述功能丧失的筛选剂抗性基因功能恢复；
所述sgRNA骨架为将序列1第571-646位中的T替换为U得到的RNA分子；
与所述sgRNA相关的生物材料为编码所述sgRNA的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因细胞系；
与所述功能丧失的筛选剂抗性基因相关的生物材料为编码所述功能丧失的筛选剂抗性基因的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因细胞系；
与所述Cas9核酸酶相关的生物材料为编码所述Cas9核酸酶的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因细胞系；
与所述胞嘧啶脱氨酶相关的生物材料为编码所述胞嘧啶脱氨酶的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因细胞系；
所述功能丧失的筛选剂抗性基因为将筛选剂抗性基因的起始密码子删除，且在筛选剂抗性基因5’端添加代理靶点靶序列后得到的序列；所述C·T碱基替换系统在靶向所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的sgRNA的向导下，可通过对所述代理靶点靶序列进行C·T碱基替换使所述功能丧失的筛选剂抗性基因功能恢复；
所述代理靶点靶序列为序列1第11305-11327位或序列10；
所述筛选剂抗性基因为外源抗性基因。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述筛选剂抗性基因为潮霉素抗性基因；所述潮霉素抗性基因序列为序列5。
3.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述sgRNA为tRNA-sgRNA；
所述tRNA-sgRNA由靶向目标基因靶点序列的tRNA-sgRNA和靶向所述功能丧失的筛选剂抗性基因靶点序列的tRNA-sgRNA组成；
所述tRNA-sgRNA结构如下：tRNA-所述靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架；
所述tRNA为将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子。
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