[发明专利]一种布鲁氏菌基因组DNA的提取鉴定的方法

说明书

本发明公开了一种布鲁氏菌基因组DNA的提取鉴定的方法。包括：从患病病人血液的血细胞中分离纯培养布鲁氏杆菌，从纯培养的布鲁氏杆菌中提取其基因组DNA，从患者血清中提取布鲁氏杆菌DNA。本发明提供了一种新的从患者全血中分离、纯培养、提取布鲁氏杆菌DNA的新方法，该方法操作简便、迅速、准确，适合于大批量血液检查，为布鲁氏菌传染病诊断提供了新技术。

技术领域

本发明涉及医学领域、生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种传染性病菌布鲁氏菌基因组DNA的提取鉴定方法。

背景技术

布鲁氏菌（Brucella）病，又称马耳他热或波浪热，简称布病。是世界上最为严重的人畜共患病之一， 170多个国家和地区都有发生和流行。在调查的 76 种危害人类健康的疾病中，布病位居第七。官方统计全球每年有超过50 万人感染布病1。由于布鲁氏菌病严重影响畜牧业的发展并对人类的健康带来巨大的威胁，对布鲁氏菌病的防治和检测日益受到各国政府的重视。

我国《动物防疫法》规定布鲁氏菌病为二类传染病，并经过多年努力在20世纪90年代初一度控制布病的流行。但随着近年来我国畜牧业的迅速发展，牛羊的市场流通频繁，养殖规模扩大，牧区养殖工和基层畜牧兽医技术人员布鲁氏菌病的发病率有上升的趋势。具中国疾病预防中心统计，2010年以来我国平均每年人感染布鲁氏病的发病数有近5万例。我国内蒙古、甘肃、青海、宁夏、新疆、河北、山西、陕西、黑龙江、吉林、辽宁等省和自治区，是我国畜牧业生产主要地区，在人和家畜中都发现了布鲁氏杆菌的病患者。

布鲁氏菌病的发生、发展和转归比较复杂，其临床表现多种多样，很难以某一种症状来确定诊断。对布鲁氏菌病的诊断，应结合病人流行病学接触史、临床表现和实验室检查等情况综合判断。例如发病前病人与疑似布鲁氏菌感染的家畜、畜产品有密切接触史，或生食过牛、羊乳及肉制品，或生活在布鲁氏菌病疫区；或从事布鲁氏菌培养、检测或布鲁氏菌疫苗生产、使用等工作。临床表现：出现持续数日乃至数周发热（包括低热），多汗，乏力，肌肉和关节疼痛等。部分患者淋巴结、肝、脾和睾丸肿大，少数患者可出现各种各样的皮疹和黄疸；急慢性期患者，表现为骨关节系统损害。

传统上诊断布病的金标准是分离培养布鲁氏菌，这种方法风险较大、耗时较长（14~40天），对实验室硬件要求很高（P2级以上实验室），且对慢性布鲁氏病几乎无效。

血清学方法是目前最普遍用于布病的检测方法。由于机体在感染布鲁氏菌约一周后便可产生特异性抗体，血清学诊断技术能通过对抗体的检测来诊断布鲁氏病。常用的血清学诊断技术主要有试管凝集试验（SAT）、虎红平板凝集试验（RBPT）、抗球蛋白试验（AHG或Coombs试验）、补体结合试验（CFT）、以及酶联免疫吸附（ELISA）试验等检测方法。其中，虎红平板凝集试验（RBPT）因为其低成本在国内广泛应用，酶联免疫吸附试验（ELISA）因为其高特异性、高灵敏的特点被OIE规定为国际贸易中制定检测方法。然而，血清学方法在感染早期没有产生抗体时，无法检测布鲁杆菌的存在。

分子生物学方法能特异性地检测到布鲁氏菌核酸，可以提高布病临床诊断的准确性，荧光定量PCR的检测方法时间长，且需要昂贵的设备和专业的操作人员。传统PCR方法相对操作简便，普通PCR仪设备普及更广，具备更好的推广性。但目前为止仍没有获得SFDA批准的商业化试剂。

无论是采用荧光定量PCR检测方法，还是传统的PCR检测方法，要想提高检测灵敏度和准确率，首先要解决从布鲁氏杆菌中提取核酸的问题，从布鲁氏杆菌中分离提取布鲁氏杆菌DNA是检测的关键，特别是当病患者初期感染布鲁氏杆菌时，病人血液中病菌含量较低，通过一系列步骤提取核酸，最后得到的布鲁氏杆菌DNA量非常的少，有时甚至提取不到DNA，造成通过采用荧光定量PCR或传统的PCR检测出现假阴性结果，贻误了患者的及时治疗。

特别是到目前为此，还没有一个成熟的完整的可用于布鲁氏杆菌核酸提取方案或技术。

发明内容