[发明专利]一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂

说明书

本发明公开了一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液‑1、稀释液‑2和清洗液。本发明联合应用了丙二醇和乙二醇两种渗透性冷冻保护剂、海藻糖非渗透性保护剂以及褪黑素(melatonin)抗氧化剂。本发明在人卵母细胞冷冻保护剂中添加具备高效抗氧化特性的褪黑素，不仅抑制了冻融后人卵母细胞胞浆内空泡的形成，而且降低了细胞内的氧自由基水平以及钙离子水平，具备保护线粒体功能，防止了人卵子在冻融过程中所遭受的氧化损伤，进而有效地保护了冻融后的人卵子质量。

技术领域

本发明涉及一种高效抗氧化的人类卵母细胞冷冻保护剂，属于生殖医学工程领域。

背景技术

2006年1月，我国首例、全球第二例“三冻(冻卵、冻精、冻胚胎，再解冻移植入母体子宫内)”试管婴儿在北京大学第三医院诞生。目前，中国ART(辅助生殖技术)衍生技术的应用范围和技术水准已处于世界前列。随着全球性不孕人口上升，女性育龄的推迟、癌症患者的增加，女性生育能力保存的需求也日益增加。卵子冷冻技术也已逐步应用于临床，与冷冻胚胎相比较，冷冻卵子一方面可使许多宗教、法律及伦理问题得以解决，另一方面对于因生殖系统疾病导致卵巢功能损伤甚至散失的妇女，如早发性卵巢衰竭、子宫内膜异位症及接受化学治疗或放射线治疗恶性肿瘤的患者，卵子冷冻是保存此类妇女生育能力的有效途径^[1]。

尽管人类卵子冷冻技术近年来取得了较大的突破，成活率大大提高，但人卵子冷冻至今仍未能像胚胎及精子冷冻在辅助生殖技术领域常规开展^[2]。根本原因是冷冻过程中累积的氧自由基使卵子的氧化-抗氧化系统失衡，造成卵母细胞的氧化应激^[3]。这种氧化应激使卵子的胞浆松散、颗粒化、含泡率升高等结构改变，以及线粒体的膜电位降低、胞内钙离子水平升高^[4-5]，这种细胞结构和功能的改变会造成冻融后的人卵子质量下降，导致人卵子冷冻技术进展较为缓慢。因此开发一种更加高效安全的人类卵子冷冻保护剂是解决人类卵子冷冻效果低下的唯一路径。

目前，没有一种人卵子冷冻保护剂具备高效的抗氧化特性，现有的人卵子冷冻保护剂仅包含非渗透性保护剂和/或渗透性保护剂。冷冻保护剂的广泛使用旨在防止人卵子遭受冷冻损伤。其中，氧化损伤是最主要的冷冻损伤之一，这种损伤不仅造成了人卵母细胞结构和功能的不可逆损伤，而且使其复苏率和发育潜能大大降低^[5-6]。氧化损伤主要表现为细胞内氧自由基水平以及钙离子水平的升高，进而引发线粒体功能的损伤，最终导致细胞功能的严重损伤或丧失^[7-8]。

迄今为止，生殖界仍没有一种人类卵子冷冻保护剂具备高效地抗氧化特性，现有的人卵子冷冻保护剂仅包含非渗透性保护剂和渗透性抵抗剂，现有的保护剂无法防止人卵子在冻融过程中所遭受的氧化损伤，这种损伤不仅造成了人卵母细胞结构和功能的不可逆损伤，而且使其复苏率和发育潜能大大降低，严重阻碍了在辅助生殖技术领域常规开展。再者，虽然有报道采用褪黑素在其他实验动物如小鼠卵细胞培养方面具备一定应用，但其研究仅限于某一方面或者其所要研究的方面而非卵母细胞冷冻损伤的防护研究；并且人卵母细胞样本相对于实验动物样本更加难以获取，这就给人卵母细胞的研究造成了较大困难，即使能够获取足够量的人卵母细胞样本，也会因为种属间的差异，如卵母细胞的直径大小，卵胞膜渗透性及弹性等参数的完全不同导致动物样本的实验结果与人的结果存在本质差异，即动物的研究结果不能直接用于人类样本。另外，迄今为止，没有关于褪黑素应用于人卵母细胞冷冻方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种具备高效抗氧化特性的人类卵母细胞冷冻保护剂，该保护剂在常用的人类卵母细胞冷冻保护剂的基础上添加内源性的高效抗氧化剂褪黑素(melatonin)，不仅抑制了冻融后人卵母细胞胞浆内空泡的形成，而且降低了细胞内的氧自由基水平、保护线粒体的功能，进而有效地保护了冻融后的人卵子质量。