[发明专利]一种万寿菊花粉诱导培养基及诱导培养方法

权利要求书

1.一种万寿菊花粉诱导培养基，其特征在于，所述培养基依据以下配方配制而成：KNO₃ 1500-1700mg/L，NH₄NO₃ 550-650mg/L，KCl 280-320mg/L，KH₂PO₄ 160-180mg/L，CaCl₂·2H₂O442-460mg/L，MgSO₄·7H₂O 139-147mg/L，H₃BO₃ 3.0-3.4mg/L，KI 0.7-0.9mg/L，MnSO₄·4H₂O 9.6-10.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.7-2.3mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O0.02-0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg/L，Na₂-EDTA 35.8-37.6mg/L，FeSO₄·7H₂O27.4-28.2mg/L，肌醇90-110mg/L，盐酸吡哆醇0.4-0.6mg/L，盐酸硫胺素0.9-1.1mg/L，叶酸1.0-1.5mg/L，5’-单磷酸腺苷3.8-4.4mg/L，色氨酸1.5-2.5mg/L，脯氨酸2.0-3.0mg/L，水解干酪素400-450mg/L，玉米冷浸液26-34ml/L，没食子酸5.0-7.0mg/L，6-BA 1.8-2.2mg/L，2,4-D 0.9-1.1mg/L，头孢噻肟37-43mg/L，硝普钠45-55μmol/L，胰岛素1.8-2.2mg/L，DMSO19-23mg/L，麦芽糖70-80g/L；玉米冷浸液的制备方法为：称取新鲜玉米粒400g，用研钵研碎，加入600ml生理盐水，浸泡4h，用双层纱布过滤，将滤液在4000r/min条件下离心处理20min，取上清液备用。

2.根据权利要求1所述的一种万寿菊花粉诱导培养基，其特征在于，所述培养基为液体培养基，其pH值为5.6-6.0。

3.一种万寿菊花粉诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）花蕾采集：将万寿菊播种育苗，进入初花期后取材，选择生长健康的万寿菊作为供体植株，在晴天上午9:00-10:00采集小孢子发育时期处于单核靠边期的花蕾用于试验；

2）花蕾预处理：将花蕾用湿纱布包好，外面包裹一层塑料膜保湿，置于4℃冰箱低温处理2d；再将花蕾置于甘露醇提取液中预处理3d；甘露醇提取液的成分为：甘露醇60g/L，CaCl₂1.2g/L，MES 1.0g/L，pH 值为5.6-6.0；

3）小孢子分离：将预处理后的花蕾进行消毒，然后将花蕾置于试管中，加入 15mL甘露醇提取液，用高速分散器超速旋切，把旋切好的悬浮液，用400目筛网过滤，滤液以700r/min、5min低速离心，重复3次，收集小孢子；

4）诱导培养：将小孢子悬浮于适量的权利要求1所述的诱导培养基中，用血球计数器调整小孢子密度，然后将悬浮液分装到直径60mm的培养皿中，每皿3mL，用封口膜封口，在24~26℃、黑暗条件下进行液体浅层静置培养。

4.根据权利要求3所述的一种万寿菊花粉诱导培养方法，其特征在于，所述步骤1）中采集的花蕾为：长度为2.3~3.0cm，花蕾纵径/横径之比为2.25~2.45，花药为黄色，小孢子处于单核靠边期。

5.根据权利要求3所述的一种万寿菊花粉诱导培养方法，其特征在于，所述步骤3）中花蕾消毒的方法为：先用清水清洗花蕾3次，再将其放入由0.1%HgCl₂+0.1%吐温20配成的消毒液中浸泡8~10min，同时用玻璃棒轻轻搅动，然后滤去消毒液，再用无菌水冲洗3次。

6.根据权利要求3所述的一种万寿菊花粉诱导培养方法，其特征在于，所述步骤4）中小孢子密度为1×10⁵~2×10⁵个/ml。