[发明专利]一种通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法

权利要求书

1.一种通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、采样培养：从食用菌二次发酵料中采集出仓二次料后，进行活化；

S2、筛选与纯化：将活化后的出仓二次料采用不同培养基进行培养，待菌落半径扩大至1厘米后，再接种进行纯化培养；

S3、鉴定：将纯化培养后的菌落进行基因组DNA提取，然后进行PCR扩增，所得产物回收后进行DNA测序，并通过比对即得到各菌落的鉴定结果。

2.根据权利要求1所述的通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述活化的条件为：将出仓二次料封装后置于55℃、湿度约为60％的培养箱中活化12小时。

3.根据权利要求1所述的通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述培养基包括PGA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、孟加拉红培养基、改良高氏1号培养基。

4.根据权利要求3所述的通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，所述PGA培养基的制备为：以1L水的量计，将蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，酵母粉1.0g，碳酸钙3g，氯化钠5g，琼脂15g溶解在水中，在121℃灭菌20min；

所述牛肉膏蛋白胨培养基的制备为：以1L水的量计，将牛肉膏5g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g溶解在蒸馏水中，调节pH7.0～7.2；121℃灭菌20min；

所述孟加拉红培养基的制备为：以1L水的量计，将蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g溶解在蒸馏水中，121℃灭菌30min；

所述改良高氏1号培养基的制备为：以1L水的量计，将可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，氯化钠0.5g，琼脂18.0g溶解在蒸馏水中，调节pH7.2-7.4；配制时将可溶性淀粉先加少量冷蒸馏水调成糊状后，再加入沸蒸馏水中；121C，20min灭菌；临用时在每300mL培养基中加3％重铬酸钾1mL。

5.根据权利要求3所述的通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述培养基为PGA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基时，培养方法如下：

取5至10克出仓二次料浸没于无菌水中，振荡后，吸取一定量的出仓二次料浸出液，将浸出液稀释出10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6六个浓度梯度，将6个浓度的菌液分别涂布于PGA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基上；

将已涂布有菌液的培养基倒置于55℃、湿度为60％～80％的培养箱中，恒温培养。

6.根据权利要求3所述的通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述培养基为孟加拉红培养基、改良高氏1号培养基时，培养方法如下：

取1.5-2.5厘米的出仓二次料接种在培养基上，倒置于55℃、湿度为70％的培养箱中，恒温培养。

7.根据权利要求1所述的通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，步骤S3中，所述基因组DNA提取的方法如下：

A、将纯化后的菌体加入缓冲液GA中振荡，得悬浮液；

B、在悬浮液中加入Proteinase K溶液，混匀；

C、向步骤B所得溶液中加入缓冲液GB，振荡后，放置一段时间，然后离心去除水珠；

D、向步骤C所得溶液中加入无水乙醇，振荡摇匀；

E、将步骤D所得混合物加入吸附柱中，离心去除废液；

F、然后加入缓冲液GD，再离心去除废液；

G、再加入漂洗液，离心去除废液；

H、重复步骤E-G，所得离心液再次离心去除废液后，室温放置；

I、向步骤H处理后的吸附柱滴加洗脱缓冲液TE，室温放置后离心，收集溶液。

8.根据权利要求1所述的通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，步骤S3中，所述PCR扩增采用的引物对序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。