[发明专利]大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法

权利要求书

1.大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，包括以下步骤：

（1）菌种制备：将大盖小皮伞菌种接种在PDA试管培养基上，于20-25℃下暗培养10-15天后，置于4℃左右的冰箱中保存备用；

（2）一级液体菌种的制备：将生长好的斜面试管菌种接至一级液体培养基，一级液体培养基配方中各组分的重量百分比为：碳源1%-3%、氮源0.2%-1%、磷酸二氢钾0.05%-0.1%、硫酸镁0.05%和维生素B₁ 0.002%-0.005%，各组分用于水溶解至容器装量的20%-60%，pH 5.5-7.5，于20-32℃下，振荡培养，摇床转速为120-200 r/min，培养4-10天，至菌丝球充满液体培养基，即可用作一级液体菌种；

（3）二级液体菌种的制备：将一级液体菌种按接种量5%-15%（V/V）的比例，接种至二级液体培养基，二级液体培养基配方中各组分的重量百分比为：碳源1%-3%、氮源0.2%-1%、磷酸二氢钾0.05%-0.1%、硫酸镁0.05%和维生素B₁ 0.002%-0.005%，各组分用于水溶解，pH5.5-7.5，容器装量及其他的培养条件同一级液体菌种，培养4-10天，至菌丝球充满全部培养基，用作二级液体菌种；

（4）生产培养基接种培养：将以上二级液体菌种按接种量5%-15%（V/V）的比例，接种至生产用液体培养基，生产用液体培养基的配方根据液体培养目标产物而定，容器装量为20%-60%，于20-32℃下，振荡培养，摇床转速为120-200 r/min，培养4-10天，至菌丝球充满全部培养基，即可用于产物收集处理；

（5）菌丝体的提取及纯化：培养至菌丝球充满全部培养基时，中止培养，采用离心法或过滤法收集菌丝体，菌丝体用水冲洗2-3次，将残余的培养基清除干净，在50-80℃ 下烘干菌丝，菌丝体产率12-15 g/L；

（6）胞外多糖的提取及纯化：步骤（5）中离心所得上清液或过滤法获得的滤液，经减压浓缩后，用醇沉法分离多糖，加入4倍体积的无水乙醇，使终浓度为75%或以上，4℃ 下静置过夜，采用离心法收集多糖，多糖进行冷冻干燥，制成多糖冻干粉；

大盖小皮伞(Marasmius maximus)菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2019228，保藏日期为：2019年4月18日。

2.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中的碳源为玉米淀粉、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉中的一种。

3.如权利要求2所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中的碳源为玉米淀粉。

4.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中的氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、牛肉浸粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨中的一种。

5.如权利要求4所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中的氮源为蛋白胨。

6.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：步骤（4）中的生产用液体培养基的配方同一级液体培养基配方；其中，当生产培养的主要目标产物为胞外多糖时，碳源为葡萄糖。

7.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：步骤（2）、（3）和（4）中的接种量为5%-10%。

8.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：步骤（2）、（3）和（4）中的培养温度为25-30℃。

9.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：步骤（2）、（3）和（4）中的摇床转速为120-150r/min。