[发明专利]一种基于荧光聚合物量子点和氧化石墨烯检测MMP-9的方法

说明书

本发明公开了一种基于荧光聚合物量子点和氧化石墨烯检测MMP‑9的方法。本发明将氧化石墨烯‑肽段‑聚合物量子点纳米复合物与含有MMP‑9的溶液共同孵育后，采用荧光光度法分析测得MMP‑9的浓度；其中：氧化石墨烯‑肽段‑聚合物量子点纳米复合物通过聚合物量子点与含有特定MMP‑9切割位点的肽段连接后，再通过静电吸附与氧化石墨烯结合构建而得；所述含有特定MMP‑9切割位点的肽段的氨基酸序列为CCYGPLGLAGRRRKKK。本发明检测方法检测灵敏度高，检测限低；同时采用的检测试剂制备方法简单。

技术领域

本发明涉及蛋白酶检测技术领域，具体的说，涉及一种基于荧光聚合物量子点和氧化石墨烯检测MMP-9的方法。

背景技术

基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是重要的前列腺癌标记物，简便、灵敏的MMP-9检测方法对监测肿瘤扩散转移至关重要。酶谱法和酶联免疫吸附(ELISA)是检测MMP-9的常用方法。然而，这两种方法步骤复杂，而且非常耗时。近年来，基于氧化石墨烯的荧光共振能量转移传感器逐渐发展用于MMP-9的检测。氧化石墨烯具有优良的猝灭特性，可以通过各种相互作用吸附荧光基团标记的肽段与寡肽，从而通过荧光共振能量转移猝灭荧光基团的荧光。常用的荧光基团包括有机荧光分子，无机量子点和金属纳米簇，但是荧光易漂白，荧光不稳定，生物相容性不好等限制了这些荧光分子生物应用。新兴的聚合物量子点具有超高的荧光亮度，比传统有机荧光分子高3个数量级，是商用无机量子点的15倍左右。同时，聚合物量子点具有光稳定性好，生物相容性良好等优点，在生物传感检测方面展现出巨大的优势。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于荧光聚合物量子点和氧化石墨烯检测MMP-9的方法。该检测方法检测灵敏度高，检测限低；同时采用的检测试剂制备方法简单。

基于目标检测物MMP-9，我们设计了一条肽段CCYGPLGLAGRRRKKK，其中区域1是PLGLAG，含有MMP-9特定识别位点G/L，区域2是RRRKKK，可以通过静电作用吸附在氧化石墨烯表面。首先CCY端与聚合物量子点通过共价作用连接，然后RRRKKK端与氧化石墨烯通过静电作用连接，最终形成氧化石墨烯-肽段-聚合物量子点纳米复合物。无MMP-9存在情况下，纳米复合物由于荧光共振能量转移效应无荧光发射现象，当 MMP-9存在时，它可以特异剪切肽段G/L位点，使得聚合物量子点远离氧化石墨烯，荧光共振能量转移消失，纳米复合物发荧光。通过分析MMP-9浓度与荧光强度，可以得到荧光强度与MMP-9浓度的线性关系。通过荧光共振能量转移效应以及MMP-9对肽段特定位点的剪切作用，实现MMP-9的检测。本发明的技术方案具体介绍如下。

一种基于荧光聚合物量子点和氧化石墨烯检测MMP-9的方法，将氧化石墨烯-肽段-

聚合物量子点纳米复合物与含有MMP-9的溶液共同孵育后，通过荧光光度法分析测得MMP-9的浓度；其中：所述氧化石墨烯-肽段-聚合物量子点纳米复合物通过聚合物量子点与含有特定MMP-9切割位点的肽段连接后，再通过静电吸附与氧化石墨烯结合构建而得；所述含有特定MMP-9切割位点的肽段的氨基酸序列为CCYGPLGLAGRRRKKK。

本发明中，孵育温度为30℃-40℃。

本发明中，荧光光度法检测时，激发波长：450nm，发射波长：536nm。

本发明中，氧化石墨烯-肽段-聚合物量子点纳米复合物通过下述步骤制得：

1）取2 g肽段溶解在4~10ml二甲基亚砜中，向其中加入0.03~0.08g碳二亚胺和0.04~0.08g琥珀酰亚胺，室温下反应20~50分钟，然后，向混合溶液中加入190~210 mg 聚合物量子点，20℃-30℃下摇动、过夜以使肽段共价结合聚合物量子点；最后透析去除多余肽段，剩下的肽段-聚合物量子点溶解于PBS中，冻干后4℃保存；