[发明专利]一种调控丹参酮合成的SmAP2/ERF152基因的克隆引物、功能及应用

说明书

本发明公开了丹参中一条参与调控丹参酮合成的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF152的编码基因序列；本发明提供的SmAP2/ERF152基因具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述基因编码蛋白质具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列。本发明检测了SmAP2/ERF152在丹参植株中的表达情况，发现其在丹参根和根的周皮部高丰度表达；亚细胞定位实验表明SmAP2/ERF152定位于细胞核；转录激活实验表明SmAP2/ERF152具有转录激活活性；构建了SmAP2/ERF152‑RNAi载体及SmAP2/ERF152‑过表达(SmAP2/ERF152‑oe)载体，通过发根农杆菌介导的丹参遗传转化获得转基因毛状根阳性株系；化学检测分析发现，在SmAP2/ERF152‑RNAi株系中，隐丹参酮和丹参酮IIA含量降低，而在SmAP2/ERF152‑oe株系中，隐丹参酮和丹参酮IIA的含量显著升高。本发明提供的SmAP2/ERF152具有正向调控丹参酮生物合成的功能，为利用生物技术提高丹参酮类化合物含量奠定基础。

技术领域

本发明属于植物分子生物学和植物基因工程领域，具体涉及一种参与调控丹参酮生物合成的SmAP2/ERF152的基因克隆和功能研究。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是中国的一种传统中草药，以其干燥的根和根茎入药。丹参酮类化合物为丹参主要活性成分之一，其主要分布于丹参根及根的周皮中，包括二氢丹参酮I(DT-I)、隐丹参酮(CT)、丹参酮I(T-I)和丹参酮IIA(T-IIA)等，其中隐丹参酮能预防和治疗缺血性疾病、冠状动脉疾病和阿尔茨海默症；丹参酮IIA在保护心肌细胞、抗心肌梗死、抗心绞痛、抗动脉粥样硬化、扩张血管和改善微循环等方面发挥显著作用。目前，由于传统种植丹参品质下降，导致市场上的丹参酮供不应求，丹参酮合成途径与代谢工程的研究成为热点领域。AP2/ERF转录因子是植物中最大的转录因子基因家族之一，在调节植物生长发育、调控活性成分生物合成和植物对环境的胁迫响应中发挥重要作用。转录因子可激活次生代谢物合成途径中多个基因协同表达，从而启动次生代谢途径。因此，转录因子基因工程可为植物次生代谢遗传改良以及合成生物学研究提供重要的靶基因和调控元件。

发明内容

本发明的目的在于提供一种参与调控丹参酮生物合成的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF152的基因及其编码的蛋白质。

本发明提供的SmAP2/ERF152基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供的SmAP2/ERF152基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明设计出了扩增SmAP2/ERF152基因特异性片段的引物，其碱基序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：基于丹参全基因组及不同丹参器官/组织转录组差异表达分析筛选出可能调控丹参酮合成的AP2/ERF转录因子SmAP2/ERF152的编码基因。

利用实时荧光定量PCR技术检测SmAP2/ERF152基因在丹参不同组织、器官中的表达谱。

构建重组质粒pCAMBIA1302-GFP-SmAP2/ERF152，转化根癌农杆菌GV3101，瞬时侵染烟草叶片，荧光共聚焦显微镜观察GFP荧光，发现SmAP2/ERF152定位于细胞核中。

构建重组质粒pGBKT7-SmAP2/ERF152，转化酵母AH109，检测SmAP2/ERF152的转录激活活性，发现SmAP2/ERF152具有转录激活活性。

构建一种含有SmAP2/ERF152基因特异性片段的正向和反向序列的植物RNAi双元表达载体。

构建一种含有SmAP2/ERF152基因全长序列的植物过表达双元表达载体。