[发明专利]一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用

说明书

本发明公开了一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用，本发明的试纸条能够对水、饲料中的喹乙醇进行定性和定量检测，样品前处理过程简单，方便快捷，检测时间短，试纸条具有很高的精密度和灵敏度；而且本发明制备的抗喹乙醇单克隆抗体特异性强，采用荧光微球标记的抗喹乙醇单克隆抗体，荧光微球的发光强度和检测信号可随着激发光强度的增强而增强，所以荧光微球标记抗喹乙醇单克隆抗体能有效提高免疫层析技术的分析灵敏度，与传统的胶体金免疫层析法相比，本发明的免疫分析法具有更高的灵敏度；同时由于荧光微球具有相对稳定的形态结构，微球粒度均一，分散性和稳定性好，发光效率高，重复性好，染料荧光猝灭大大减少。

技术领域

本发明属于生物技术中的时间分辨荧光免疫分析技术领域，具体涉及一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用。

背景技术

喹乙醇(Olaquindox，OLA)是一种抗菌促生长剂，曾广泛应用于水产养殖，一度被称为“水产瘦肉精”。喹乙醇的毒副作用不容小觑，存在明显的遗传毒性和蓄积毒性，因此国内外相继制定了严格的使用规范和残留限量标准。如美国和欧盟禁止使用喹乙醇，日本规定喹乙醇在动物组织和内脏中的最大残留限量(MRL)为300μg·kg^-1，我国农业部在2001年发布的第168号公告《饲料药物添加剂使用规范》中规定饲料中的添加量不得高于50mg·kg^-1，同时规定禁止在鱼、禽及体重超过35kg猪的养殖过程中使用。尽管如此，抗菌促生长效果好且廉价的喹乙醇目前仍存在违规添加使用的现象。因此，加强喹乙醇的检测监督，特别是加强喹乙醇检测技术的研究极为必要。

喹乙醇的残留检测方法，主要包括传统的仪器分析和免疫分析两大类。其中仪器法主要包括光谱法、色谱法以及液质联用技术等，仪器分析准确度高、精密度强，但其样品前处理过程复杂繁琐、耗时长、需要专业技术人员操作、仪器试剂等价格昂贵，无法在基层得到极大推广。免疫分析技术凭借着其高效、快速、高灵敏度以及高特异性等优势广泛应用于小分子药物残留检测中。目前常用的免疫检测方法主要包括酶联免疫检测法、胶体金免疫层析、荧光免疫分析等，但存在灵敏度不理想，假阳性和假阴性等问题。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条，包括底板、样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在底板上，样品结合垫的末端与硝酸纤维素膜的始端连接，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；所述样品结合垫上包埋有荧光微球标记的抗喹乙醇单克隆抗体；

所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区；检测区位于接近样品结合垫的一侧，质控区位于远离样品结合垫的一侧，质控区喷涂有羊抗鼠二抗，检测区喷涂有喹乙醇半抗原-载体蛋白偶联物，所述喹乙醇半抗原-载体蛋白偶联物为喹乙醇半抗原-卵清白蛋白偶联物OLA-A-OVA，

喹乙醇半抗原-卵清白蛋白偶联物由以下步骤制备得到：

(1)向三口圆底烧瓶中准确加入2.106g喹乙醇和2.274g的oxocane-2,8-dione，加入80-90mL吡啶，115℃下回流反应5-6h后减压蒸除吡啶，向剩余混合物中加入60mL冰蒸馏水，2mol·L^-1HCl调pH至2.0～3.0，4℃下放置过夜；减压抽滤并用冰蒸馏水洗涤后抽干，得到的物质即为喹乙醇半抗原OLA-A，-A表示-CO(CH₂)₅COOH；合成路线为：