[发明专利]用于切割靶DNA的系统及其用途

权利要求书

1.用于在真核细胞或真核生物中切割靶核酸的II型CRISPR/Cas系统，所述CRISPR/Cas系统包含：

(i)Cas9多肽或编码Cas9多肽的核酸，和

(ii)特异于靶核酸的向导RNA或编码向导RNA的核酸，

其中该向导RNA是包含与靶核酸杂交的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)的dualRNA，或者包含crRNA和tracrRNA的至少部分并与靶核酸杂交的单链向导RNA(sgRNA)。

2.包含权利要求1的系统的分离的真核细胞或真核生物。

3.一种体外切割真核细胞或真核生物中的靶核酸的方法，包括用权利要求1的系统转染包含靶核酸的真核细胞的步骤。

4.一种制备真核细胞或真核生物的方法，包括用权利要求1的系统转染包含靶核酸的真核细胞或真核生物的步骤。

5.制备基因组修饰的动物的方法，包括：将权利要求1的系统引入动物的胚胎；和将胚胎转入假孕代母的输卵管以产生基因组修饰的动物，其中所述动物和假孕代母不是人类。

6.制备基因组修饰的植物的方法，包括：

(1)将权利要求1的系统转染进入包含靶核酸的真核细胞或真核生物的原生质体，和

(2)再生原生质体以产生基因组修饰的植物。

7.权利要求3或权利要求4的方法制备的真核细胞或真核生物。

8.改变至少一种基因产物的表达的方法，包括向包含和表达具有靶序列并编码基因产物的DNA分子的真核细胞引入包含载体的成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统，该载体包含：

a)编码与靶系列杂交的CRISPR-Cas系统向导RNA的核酸，和

b)编码Type-IICas9蛋白质的核酸，

其中向导RNA靶向靶序列且Cas9蛋白质切割DNA分子，

由此该至少一种基因产物的表达被改变；和，

其中该Cas9蛋白质和该向导RNA不天然存在在一起。

9.II型CRISPR-Cas系统，其包含Cas9蛋白质和至少一种靶向真核细胞中的DNA分子靶序列并与该靶序列杂交的向导RNA，

其中该DNA分子编码至少一种基因产物，该真核细胞表达该至少一种基因产物，而Cas9蛋白质切割该DNA分子，

由此该至少一种基因产物的表达被改变；

其中该Cas9蛋白质和该向导RNA不天然存在在一起；和，

其中该向导RNA包含tracr序列与融合的向导序列。

10.制备用于在真核细胞或真核生物中切割靶核酸的重组Cas9多肽的方法，包括：

(i)使用人类密码子使用表重构并使用寡核苷酸合成编码Cas9多肽的核酸序列，

(ii)使用重叠的寡核苷酸和聚合酶组装DNA片段，并克隆到T-载体，

(iii)通过重叠PCR，使用DNA片段组装全长Cas9序列，

(iv)所述Cas9编码DNA片段亚克隆到p3s，在此载体中，包含HA表位和核定位信号(NLS)的肽标签加至Cas9的C末端，通过蛋白质印迹，使用抗HA抗体，确认细胞中Cas9蛋白质的表达和核定位，

(v)将Cas9盒亚克隆到pET28-b(+)，并转化到BL21(DE3)，使用IPTG诱导Cas9表达。

11.制备用于在真核细胞或真核生物中切割靶核酸的向导RNA的方法，包括：

(i)筛选靶核酸的基因组序列，检查外显子中NGG基序的存在；

(ii)通过两个部分重叠的寡核苷酸延伸产生一个或多个DNA模板；

(iii)使用模板DNA转录向导RNA。