[发明专利]一种检测干血滤纸片样品中维生素B1三种标志物的方法及其制备方法

说明书

本发明公开了一种检测干血滤纸片样品中维生素B1三种标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤I、采集装置的准备；步骤II、干血片样品样品的采集及保存处理；步骤III、干血片样品前处理中的目标化合物的萃取；步骤IV、干血片样品的衍生化、pH调节及高效液相UPLC分析；步骤V、高效液相UPLC的分析与定量，其中，所述的样品为指间或足跟采集的毛细血管血液或从抗凝管中收集的静脉全血样品，可使用经过EDTA或者肝素抗凝处理的血样，用于人群分析以及临床试验的维生素B1营养成分的测定，其使用样品量低、简单灵敏，特异型强、重复性好、稳定性好、且所需成本较低。

技术领域

本发明涉及一种血液检测方法技术领域，尤其是涉及一种检测干血滤纸片样品中维生素 B1三种标志物的方法及其制备方法。

背景技术

作为一种水溶性的维生素，维生素B1又称硫胺素，其作为一种必须营养物质在能量的产 生和代谢过程中起着重要的作用。维生素B1的缺乏常见的会导致脚气病、视神经病变以及其 他增加婴儿死亡率的相关疾病。因此准确了解高危人群(如东南亚及其他欠发达地区，包括 中国农村地区)的维生素B1的水平对于人群调查以及临床试验有着总要的意义。鉴于人群调 查等质的研究常常涉及到大数量、有限的血液体积的队列样品，因此如何在较低成本下准确 从较少量的样品中检测维生素B1具有重要实践意义。

维生素B1在血液中的存在主要是以硫胺素二磷酸TDP为主要成分，约占80％-90％的总B1 浓度。根据发明人的调研发现目前国内已申报的专利中，针对B1三种标志物全水平的检测仅 为申请人前期所申报的专利(申请号：201920772914.8)。然而该专利所存在为其对于样品 的采集、储存、运输条件要求较高。干血滤纸片(Dried blood spot)技术作为1962年开始便 应用于临床的新生儿先天疾病筛查中，有着独特的优点。主要包括样品采集方便、血样量低、 存储运输成本低且方便等等优点。发明人通过前期的专利以及中、英文科研文献调研发现， 目前维生素B1应用于干血滤纸片检测的技术尚存在明显不足，对于人体内B1的检测仍旧只集 中在标志物中的硫胺素Th(约占总B1的<5％)，因此无法准确评价病人的B1的真实水。

发明内容

针对背景技术中存在的技术空缺，本发明的目的为克服上述现有的技术不足而开发一种 在干血滤纸片样品中同时检测维生素B1三种重要的标志物(Th、TMP以及TDP)，低成本的 稳定可靠的基于高效液相的分析方法。为实现上述目的，主要包括以下步骤：

一种检测少量全血样品中维生素B1三种标志物的方法，包括以下步骤：

步骤I、采集装置的准备；

步骤II、干血片样品样品的采集及保存处理；

步骤III、干血片样品前处理中的目标化合物的萃取；

步骤IV、干血片样品的衍生化、pH调节及高效液相UPLC分析；

步骤V、高效液相UPLC的分析与定量；

其中，所述的采集装置的准备为经过剪裁成5cm×2cm尺寸的、无污染的Whatman^TM公司的903型号的纤维素纸。

作为本发明进一步的技术方案，所述步骤I中样品的预处理操作为：经过10mg/mL抗氧 化剂2,6-二丁基对甲酚(BHT)的预涂层并阴凉干燥后的装置。

作为本发明进一步的技术方案，所述步骤II中样品的保存处理操作为：待新鲜指间、足 跟、或者经静脉采集的抗凝血样滴到上述903滤纸上后，在避光、室温(23～28℃)、湿度 45～65％的环境中干燥约3h。而后将干燥的干血滤纸片样品以及经过活化的干燥剂置于铝箔自 封袋中，排去自封袋中主要的空气，并封装铝箔袋。封装保存的样品可在室温保存1～3天、 或于≤-20℃冰箱中>6个月。