[发明专利]一种重组果胶甲酯酶PbrPME的体外表达方法及其编码基因与应用

权利要求书

1.一种梨PbrPME蛋白体外表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物PCR扩增梨PbrPME基因；

b.构建表达梨PbrPME蛋白的原核重组表达载体；

c.将步骤b构建的原核重组表达载体转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建PbrPME重组表达菌株；

d.培养步骤c所构建的PbrPME重组表达菌株至OD₆₀₀达到0.3-0.5，并低温处理后，加入诱导剂IPTG，诱导表达梨PbrPME蛋白；

e.纯化诱导表达的梨PbrPME蛋白。

2.根据权利要求1所述的梨PbrPME蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤a中，用于PCR扩增梨PbrPME基因的正向引物为5’-CCCTCGAGATGAAAAACAAAGGAGGAGGAG-3’，反向引物为5’-GCTCTAGAAACGGAAACCATGCCAGC-3’。

3.根据权利要求1或2所述的梨PbrPME蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤a中，PCR扩增梨PbrPME基因的PCR反应体系为：ddH₂O 31μl，上下游引物各2.5μl,cDNA 1μl,5×Phusion GC Buffer 10μl,10mM dNTPs 1μl,50mM MgCl₂ solution 1μl,Phusion DNAPolymerase 1μl；PCR反应条件为：98℃预变性30min，然后进行98℃10s，60℃30s，72℃2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的梨PbrPME蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤b中，构建表达梨PbrPME蛋白的原核重组表达载体时，所使用的原核表达载体为大肠杆菌表达载体pCold-TF，克隆梨PbrPME基因的插入位点为Xho I和Xba I酶切位点之间。

5.根据权利要求4所述的梨PbrPME蛋白体外表达的方法，其特征在于，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收，回收产物用Xho I和Xba I限制性内切酶双酶切后连接到经同样双酶切的大肠杆菌表达载体pCold-TF的Xho I和Xba I位点上。

6.根据权利要求1所述的梨PbrPME蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤d中，所述的低温处理为置于冰上5-10min，然后10-15℃静置40-50min，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.3-0.5mmol/L，所述诱导表达的条件为15℃诱导22-24h。