[发明专利]一种基于ITS2序列快速鉴定地肤子与其混伪品的方法

权利要求书

1.一种基于ITS2序列快速鉴定地肤子与其混伪品的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）提取待测地肤子样品DNA，PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列，将 PCR 产物正向测序，经过ITS2 database剪切获得地肤子ITS2序列；（2）采用ClustalW方法进行多重序列比对，应用MEGA 6.06软件构建NJ系统发育树（Neighbor-Joining tree），利用Bootstrap法进行1000次重复分析，检验各系统发育枝的支持率，分析各物种分支是否具有单系性；（3）应用MEGA 6.06软件基于双参数模型Kimura two-parameter (K2P)计算种内与种间平均遗传距离；（4）通过ITS2 database (http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de)预测地肤子及其混伪品ITS2二级结构；（5）如果NJ树中地肤子的ITS2序列聚类在一起，地肤子种内平均遗传距离显著小于地肤子与其混伪品的种间平均遗传距离，且地肤子二级结构与其混伪品二级结构差异大，说明ITS2序列可快速准确鉴定地肤子与其混伪品。

2.根据权利要求1所述的一种基于ITS2序列快速鉴定地肤子与其混伪品的方法，其特征在于步骤（1）中所述地肤子DNA提取方法为：取地肤子药材样品干重组织约30 mg，加入液氮充分碾磨并充分离心后，利用植物组织DNA快速提取试剂盒（天根DP305）提取总DNA；PCR扩增采用ITS2通用引物S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和S3R: 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；扩增反应采用50μL体系，包括模板 DNA 4μL、正向引物和反向引物各0.7μL，PrimeSTAR®HS Premix 25μL（购自TAKARA公司），ddH2O 19.6μL；PCR扩增程序为 94 ℃预变性2 min，1个循环；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃ 延伸30 s，40个循环；72 ℃最后延伸 5 min，进行1个循环，4℃保存扩增产物；PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，并进行正向测序，最后经过ITS2 database剪切获得地肤子ITS2序列。