[发明专利]拮抗PD-1骆驼抗体类似物AP基因及蛋白和应用

说明书

本发明公开了一种拮抗PD‑1骆驼抗体类似物AP基因及蛋白和应用,在分析PD‑L1与其抗体Avelumab结合模式后，确定了Avelumab与PD‑L1相互作用CDR区的关键氨基酸，并将这些参与结合的关键区域截取、移植到骆驼抗体的CDR区，构建了PD‑L1抗体Avelumab的骆驼抗体类似物AP基因及蛋白。AP蛋白性质稳定，分子量小，能够在大肠杆菌中表达。进一步通过生物实验验证了AP蛋白的功能活性。为开发有临床应用前景的免疫检测点抑制剂先导药物奠定了实验研究基础。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种拮抗PD-1骆驼抗体类似物AP基因及蛋白和应用。

背景技术

程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)是T细胞上的一种跨膜受体，PD-1能够与配体PD-L1、PD-L2相互作用，抑制T细胞增殖和功能。在正常机体中，PD-1作为一种T细胞活化后表达的负调节分子，能够结合相应配体PD-L1/2，调控T细胞活化和功能，抑制过度免疫反应，从而防止由此可能导致的组织损伤，对维持机体的免疫耐受有重要作用，是重要的免疫检测点(immune chekpoint)机制之一^[1]。而在肿瘤和病毒感染时，靶细胞PD-L1和PD-L2表达上调，与T细胞表面的PD-1受体结合，传递负调控信号，能够抑制T细胞的活化、增殖及对靶细胞的杀伤，使肿瘤和感染细胞逃逸机体的免疫监控和免疫杀伤^[2]。因此，以PD-1/PD-Ls信号通路分子为靶标，研发针对PD-1或PD-Ls的阻断剂，即免疫检测点抑制剂(immune chekpoint inhibitors，ICIs)，能够增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤。目前,已经有多个抗PD-1和PD-L1抗体药上市或者进入临床试验阶段。2017年，FDA批准了由默克/辉瑞公司开发的PD-L1抗体Avelumab(Bavencio)用于治疗Merkel细胞癌(成人或12岁以上儿童)和晚期或转移性尿路上皮癌，为众多癌症患者带来了新的希望^[3]。

抗体分子是B淋巴细胞产生的一类大分子蛋白，它由两条重链和两条轻链组成，由于抗体具有高度的亲和性和特异性等特点。利用抗体分子作为药物治疗疾病已经在临床上广泛应用，其销售额每年都快速递增。全球抗体类药物销售额从2011年的不到500亿美元增加到2017年的1060亿美元。因此，抗体是重要的生物药物。尽管抗体分子有着较强的结合能力和选择性，但是由于抗体本身的一些性质，如相对分子质量大(约为1.5x10⁵)、结构复杂、依赖二硫键的连结等，也导致了抗体分子的热稳定性差、制备过程复杂、进入实体瘤效率低等问题^[4]。因此，抗体的临床应用仍然具有较大的局限性。然而，骆驼单链抗体(VHH)是一种独特的仅由重链组成的小分子抗体。由来自骆驼科的仅有重链的抗体衍生的纳米抗体具有分子量小，高溶解度，高稳定性的特点，与人VH3基因的同源性高，更适合作为移植骨架。与人源VH比较发现，骆驼来源的VHH骨架区仅有十几个氨基酸不同，并且结构非常相似^[5]。纳米抗体结合抗原的互补决定区(complementary determine region，CDR)类似于人抗体分子中CDR区(见图1(自蛋白数据库Protein data bank database，5GRJ和1MEL))，可以被替换或突变,形成一个新的抗体^[6]。在生产方面，骆驼来源抗体能够在大肠杆菌中高效、可溶性表达。综上所述，纳米抗体，具有比其他治疗药物具有多竞争优势。随着2018、2019年欧盟和FDA先后批准第一个纳米抗体，赛诺菲公司开发的纳米抗体药物Cablivi用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜^[7]，基于骆驼抗体骨架蛋白设计的新型抗体类药物有望成为新一代生物药物，在临床上有广泛应用前景。

参考文献：

1.Sharpe A H,Pauken K E.The diverse functions of the PD1 inhibitorypathway[J].Nature Reviews Immunology,2018；18(3):153-167.