[发明专利]一种蛋白表达及纯化的方法

说明书

本发明公开了一种蛋白表达及纯化的方法，首先构建含有绿色荧光蛋白gfp基因的表达载体，将目的蛋白基因插入该表达载体中，再将含有绿色荧光蛋白GFP和目的蛋白融合基因的表达载体转入表达菌株中诱导表达，通过在荧光显微镜下观察表达菌株是否发出绿色荧光来判断融合蛋白是否被成功表达。表达出融合蛋白后，通过亲和层析纯化的方法获得纯融合蛋白，蛋白酶切除GFP蛋白，获得纯目的蛋白。该方法可以直观检测目的蛋白的表达情况，方便快捷，且纯化蛋白的效果好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白表达及纯化的方法。

背景技术

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，由下村修等人1962年在水母中发现，其由gfp基因编码，该蛋白在蓝色波长光线激发下会发出绿色荧光，这使得绿色荧光蛋白GFP作为标签蛋白在生物技术领域被广泛使用。GFP介导的融合蛋白标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术，此标签技术可应用于细胞内基因表达水平的检测、蛋白质的细胞内原位示踪与定位、目的蛋白的纯化以及增强重组蛋白的可溶性及稳定性等。

目的蛋白在原核系统中的表达和纯化是分子生物学研究和生物技术产业化发展过程中的重要工具，是对目的蛋白功能和性质研究的基础，更促进了现代生物学科迅猛发展。在各种版本的分子生物学实验指南中，目的蛋白的表达和纯化的基本流程是：1、将目的基因克隆到合适的表达载体上后导入原核细胞表达系统菌株；2、诱导表达菌株表达目的蛋白；3、通过目的蛋白所带的融合蛋白标签如GST、His等，选择不同性质的层析柱料将目的蛋白与其它蛋白分离，从而达到纯化目的蛋白的目的。

然而目前没有直观实时检测目的蛋白表达纯化情况的方法。根据目前常用的实验技术，无论是先少量诱导后检测目的蛋白是否表达，还是最后检测是否通过层析柱料得到了纯化的目的蛋白，都需要将蛋白样品通过十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并对蛋白进行染色的方法来检测目的蛋白表达纯化情况。SDS-PAGE检测蛋白需要先将蛋白样品加上样缓冲液制样，配制聚丙烯酰胺凝胶，然后电泳大约1个小时，最后还需要将蛋白染色才能最终知道目的蛋白是否已经表达或者得到纯化，这些检测都需要花费很多的步骤和时间。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种蛋白表达及纯化的方法，便于直观检测目的蛋白表达纯化情况，操作简便快捷，正确率高，不需要进行反复的筛选验证，节约时间，节约成本。

本发明的技术方案是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种蛋白表达的方法，包括如下步骤：

S1、绿色荧光蛋白gfp基因的扩增，扩增上游引物设置有编码烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的序列，gfp基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

S2、将步骤S1所述gfp基因连接到质粒pET-28a上，得到表达载体pET-28a-gfp；

S3、扩增编码目的蛋白X的基因x；

S4、将步骤S3所述基因x连接到表达载体pET-28a-gfp上，得到表达载体pET-28a-x-gfp；

S5、将表达载体pET-28a-x-gfp转入表达菌株中诱导表达融合蛋白X-GFP。

在以上技术方案的基础上，优选的，在构建所述表达载体pET-28a-gfp过程中，在gfp基因上带有限制性内切酶XhoI的酶切位点。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述表达载体pET-28a-gfp的完整核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在以上技术方案的基础上，在所述表达载体pET-28a-gfp上，绿色荧光蛋白gfp基因上游有多克隆位点，用于插入目的基因，根据目的基因碱基数目插入到合适酶切位点之间，使得目的蛋白与GFP蛋白能融合表达。