[发明专利]一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法

权利要求书

1.一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测与鉴定细菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、待检测样品核酸DNA的提取；

(2)、引物对的设计：应用软件设计巢式PCR引物，具体的引物序列包括如下：

第一次PCR扩增引物：

正向引物：F1：5’-TAGCT/GGGTCTGAGAGGATGA-3’，SEQ ID NO：1，其中T/G为兼并性碱基；

兼并性碱基T/G采用K指代，即为5’-TAGCKGGTCTGAGAGGATGA-3’；

反向引物：R1：5’-ATGTGTGGCGGGCAGTGT-3’，SEQ ID NO：2；

第二次PCR扩增引物：

正向引物：F2：5’-TACGGGAGGCAGCAGT-3’，SEQ ID NO：3；

反向引物：R2：5’-ACTAGCGATTCCGACTTCA-3’，SEQ ID NO：4；

(3)、以步骤1提取的核酸DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物，通过PCR反应第一次扩增待检核酸DNA，得到第一次PCR产物的核酸DNA；利用SEQ ID NO:3-4所示引物，通过PCR反应第二次扩增第一次PCR产物的核酸DNA；

(4)检测并分析PCR扩增产物；

(5)PCR产物测序；

(6)对步骤(5)测序核苷酸序列进行分析，确定细菌性微生物的类型。

2.按照权利要求1所述的一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，待检测样品核酸DNA的提取：从包括乳汁，水和组织液等待检测样品中提取的核酸DNA。

3.按照权利要求1所述的一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，其中PCR扩增反应：将对应的核酸DNA加入对应的PCR反应混合液中，进行PCR扩增；所述PCR反应混合液，包括：PCR缓冲液10×Buffer，4种dNTP混合物溶液，Taq酶、引物和双蒸馏水的混合液。

4.按照权利要求2所述的一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，

作为本发明的优选方案：所述的巢式PCR，第一次PCR反应体系包括：PCR缓冲液10×Buffer(Mg²⁺，15mmol/L)2.5μL，4种dNTP混合物溶液2μL，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μL)0.2μL，正向引物F1溶液和反向引物R1溶液各0.4μL(浓度为10μmol/L)，待检测样品核酸DNA的提取液4μL，补充双蒸馏水至25μL体积；

作为本发明的优选方案：所述的巢式PCR，第二次PCR反应体系包括:PCR缓冲液10×Buffer(Mg²⁺，15mmol/L)2.5μL，4种dNTP混合物溶液2μL，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μL)0.2μL，正向引物F2溶液和反向引物R2溶液各0.4μL，第一次PCR扩增产物核酸DNA溶液4μL，补充双蒸馏水至25μL体积。

5.按照权利要求3所述的一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，各引物溶液的浓度为10μmol/L；dNTP混合物溶液中各NTP即A、T、G和C的浓度均为2.5mmol/L。

6.按照权利要求1所述的一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，所述的巢式PCR，第一次PCR反应的条件为：95℃预变性4min；95℃变性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min；第二次PCR反应的条件为：95℃预变性4min；95℃变性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min。