[发明专利]一种固相合成帕瑞肽的制备方法

权利要求书

1.一种固相合成帕瑞肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH连接到2-CTC Resin载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段H-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH即：首先，称取2-CTC Resin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH并加入约DMF溶解同时冰水浴降温，加入DIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入DIPEA继续反应约2h，反应结束后，依次加入DMF，MTBE,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min，封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MTBE收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.719mmol/g，其次，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-O-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉，加入适量5％PIP/2％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min，加入DMF,MeOH,DMF交替洗涤2轮，称取Fmoc-Phe-OH,2.03gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入2.62mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入5.69gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全，反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH；最后，将上述所得片段(1-6)肽树脂加入到280mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体，测得ESI-MS；

S2，在液相体系中用缩合试剂将六肽片段进行环化得到环肽片段Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]，即：称取全保护六肽片段于烧瓶中并加入适量THF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性，称取HOBt于烧杯中，加入THF搅拌至溶解，随后加入DIPEA并用冰水浴降温至-5℃，再加入3.66gHBTU，保持-5℃反应1h后自然回至室温反应3h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程，反应结束后，减压旋蒸溶剂THF至20％体积，冷却后挤兑到适量的5％磷酸水溶液中，打浆，过滤，滤饼再用5％磷酸水溶液打浆洗涤2遍，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3遍，水洗涤3遍，正庚烷洗涤1遍，过滤并真空干燥得到白色固体，测得ESI-MS；

S3，在液相体系下，用适当比例，浓度TFA/H2O/TIS，条件下酸解脱除环肽片段上Boc保护基，并用冰冻MTBE或乙醚沉降，过滤及干燥得到帕瑞肽粗品Cyclo-[Phg-D-Trp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp(2-aminoethylcarboxyl)]，即将上述所得全保护环肽Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxy l]]片段溶于预先冷至0-5℃的100mL95％TFA/2.5％H2O/2.5％TIS溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度不超过15℃，然后将反应升温到25±2℃，搅拌反应30分钟，将切割液加入到冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重,测得ESI-MS,粗品HPLC纯度，收率。