[发明专利]测定酶活性的方法

说明书

本发明适用于酶检测技术领域，提供了一种测定酶活性的方法，包括以下步骤：S1：对金属蛋白酶的酶切底物进行重组蛋白纯化；S2：对酶彻底物进行酶切反应；S3：读取酶切反应后的金属靶板，并对样本内的酶切活性进行计算。借此，本发明灵敏度、准确性好，操作简便，价格便宜，应用范围广泛。

技术领域

本发明涉及酶检测技术领域，尤其涉及一种测定酶活性的方法。

背景技术

血栓性微血管病主要包括四类疾病：血栓性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症综合征、恶性高血压肾损害、先兆子痫肾损害。

血栓性微血管病临床上主要表现为血小板减少、溶血性贫血和微循环中血小板血栓造成的器官受累，其临床表现与血栓性微血管病的病变范围和累及不同器官造成的功能障碍有关。

该病涉及的临床科室非常广泛，患者往往可能在不同的科室，如肾脏内科、血液科、神经内科、妇产科、皮肤科、心血管内科和呼吸科等就诊，如接诊医生缺乏对该病的认识，往往会造成严重的误漏诊，故提高对该类疾病的认知度已成为目前国内外相关专业领域内的关注热点。

血栓性微血管病临床表现非常相似，但是治病机理则完全不同，其中血栓性血小板减少性紫癜有一个最大的区别就是金属蛋白酶的酶活性有显著性差异。不管是遗传性还是获得性血栓性血小板减少性紫癜病人的金属蛋白酶的酶活性一般都小于5％，而其他类型的血栓性血小板减少性紫癜的发病跟金属蛋白酶的酶活性缺失没有关系，所以其他类型的血栓性血小板减少性紫癜病人的金属蛋白酶的酶活性正常。。

早期的检测技术包括免疫放射测定、胶原结合法、瑞斯托霉素辅因子，底物为全片段长瑞斯托霉素辅因子，多聚体，需要添加变性剂进行解折叠，但是人体内并无变性剂，不符合生理学条件，反应时间较长，1-2天左右时常导致病人因无法及时诊断、治疗而丧失生命。

荧光共振能量转移法：化学合成底物FRETS-vWF73，底物被特异性裂解后会减轻荧光淬灭作用，即正常人血浆和底物作用后会使荧光增强，金属蛋白酶活性缺失的患者无影响或荧光减弱。此技术需要实验室配制价格不菲的多功能酶标仪，带荧光检测功能，并且化学合成底物的成本昂贵，导致多数病人因无法负担而放弃检测。

利用酶联免疫吸附测定金属蛋白酶的酶活性是最近几年流行起来的方法，基于双抗夹心法技术，预先包被对底物具特异性抗体的酶标板孔，先后加入底物和血浆样本混合孵育，再加入酶标抗体和显色液，当底物和含有金属蛋白酶的血浆样本混合孵育后，底物被金属蛋白酶所裂解，酶标仪的吸光度值就较低。如果血浆样本中的金属蛋白酶活性较低或者存在先天性金属蛋白酶缺陷，则吸光度值较高。此重组蛋白分子量较大，测试技术过程复杂且耗时较长，难以迎合大规模血栓性血小板减少性紫癜筛查的需求，也不适用于急诊室病人紧急诊断、治疗的临床需求。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种测定酶活性的方法，其可以快速有效的实现对酶活性的检测，降低治疗成本，提高治愈率。

为了实现上述目的，本发明提供一种测定酶活性的方法，包括以下步骤：

S1：对金属蛋白酶的酶切底物进行重组蛋白纯化；

将氨基酸片段以及其末端的组氨酸插入到细菌表达载体上并进行克隆，然后对细菌进行收集后对其进行裂解，裂解完成后进行离心处理，并对离心处理后的细菌进行上清收集，然后加入等体积的缓冲液进行稀释，利用还原性离子柱对稀释后的液体进行洗脱，进而得到所需的酶彻底物；

S2：对酶彻底物进行酶切反应；

将酶彻底物用反应缓冲液进行稀释，然后取其血清标准物，与所测血清样本进行稀释后的底物溶液进行混合，将混合后的液体进行孵育，对孵育后的溶液加热至预设温度后终止反应；