[发明专利]一种判定蛋白质能否发生液-液相分离的方法

说明书

一种判定蛋白质能否发生液‑液相分离的方法，属于基因工程技术领域。为了解决目前研究蛋白能否发生“液‑液相分离”所用方法步骤繁琐，费时费力，原核表达易形成包涵体的问题，本发明提供了一种判定蛋白质能否发生液‑液相分离的方法。本发明所述的方法具体包括如下步骤：构建含有体外转录启动子、待测蛋白以及标记蛋白基因的载体，以此载体为模板，PCR扩增后进行体外转录，获得融合基因的mRNA，将mRNA注射到受精卵中，培养15‑20小时之后通过荧光显微镜观察是否发生“液‑液相分离”。本发明以受精卵为载体，通过注射的方式使体外转录的mRNA在受精卵中进行表达，操作非常简单，结果清晰，并且能在短时间内获得结果。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种判定蛋白质能否发生液-液相分离的方法。

背景技术

近年来，蛋白质液液相分离(Liquid-liquid Phase Separation,LLPS)逐渐成为生物学研究的热点之一。它在生命体的正常代谢和疾病过程中都发挥着非常重要的作用。随着越来越多的探索LLPS具体发生机制的报道，人们发现影响蛋白质LLPS的因素主要来自于两个方面：一是蛋白质序列性质，如突变及翻译后修饰的影响；二是受到体系微环境，比如温度、蛋白质浓度、pH值、盐浓度、压力等的调节。目前研究某种蛋白能否发生“液-液相分离”主要是体外表达纯化蛋白，然后在一定的缓冲液中观察该蛋白能否发生相变。该方法步骤繁琐，费时费力，涉及表达载体设计及构建、(真核或原核系统)诱导表达蛋白、蛋白纯化、蛋白透析、蛋白浓缩等环节，如果采用原核表达系统，还有可能出现表达蛋白错误折叠形成包涵体的情况，需要变性及复性处理，更增加了实验的复杂性。

发明内容

为了解决目前研究蛋白能否发生“液-液相分离”所用方法步骤繁琐，费时费力，原核表达易形成包涵体的问题，本发明提供了一种判定蛋白质能否发生液-液相分离的方法。本发明所述的方法具体包括如下步骤：

(1)构建待测蛋白质的体外转录元件，所述体外转录元件是由体外转录启动子，待测定蛋白质的基因序列与编码荧光蛋白基因相连接所形成的融合基因；

(2)体外转录获得融合基因的mRNA；

(3)将步骤(2)所获得的mRNA注射到受精卵中；

(4)对注射后的受精卵进行培养，培养15-20小时，通过荧光信号判定待测定蛋白质是否发生液-液相分离。

优选的，步骤(1)所述的体外转录启动子是T7启动子，序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，步骤(3)所述的mRNA注射到受精卵中是注射到受精卵的细胞质或细胞核中。

优选的，步骤(3)所述的mRNA注射浓度是50-300ng/μl。

优选的，其特征在于，步骤(3)所述的mRNA注射浓度是150ng/μl。

优选的，步骤(3)所述的mRNA注射参数是注射压力为80-200hpa，注射时长0.1s，补偿压力100-300hpa。

优选的，步骤(3)所述的受精卵为鼠受精卵。

优选的，步骤(1)所述受精卵培养条件是37℃，CO₂的浓度是5％。

优选的，步骤(4)所述的判定待测定蛋白质是否发生液-液相分离是通过荧光显微镜观察，形成的荧光信号是圆形，则发生液-液相分离，呈现弥散性分布则未发生液-液相分离。

有益效果

本发明以受精卵为载体，通过注射的方式使体外转录的mRNA在受精卵中进行表达，操作非常简单，因为能够发生液-液相分离的蛋白在受精卵中表达后是液滴状，所以在显微镜下观察是非常规则的圆形信号，结果清晰，并且能在短时间内获得结果。

附图说明