[发明专利]一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒

说明书

本发明公开了一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒，包括特异性引物对及包含该引物对的试剂盒，其中试剂盒包括试剂一、试剂二和封闭剂；试剂一包含Ft、Bt、IF、IB、dNTP、BstDNA聚合酶、指示剂；试剂二包含(NH₄)₂SO₄、KCl、MgSO₄、Tween20和甜菜碱，pH8.0。本发明提供的试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，不仅适合大人流、快速通关背景下的现场检疫查验检测需求，也适合实验室快速检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒。

背景技术

铜绿假单胞菌(PseudomonasAeruginosa)俗称绿脓杆菌，环境中普遍存在，尤其在潮湿环境。铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一，常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。该菌引起的感染病灶可导致血行散播，进而发生菌血症和败血症，因而，烧伤后感染铜绿假单胞菌可能造成死亡。该菌易感染者为患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤以及术后或某些治疗后的患者。该菌可通过医护人员传给病人，是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌；该菌还是尿路感染的常见病原菌，也是外耳炎的常见病原菌；因角膜接触镜片或镜片液体污染而感染该菌，可造成眼部感染角膜溃疡；足部外伤或深部穿刺伤后，引流的窦道可发现该细菌，引起蜂窝织炎和骨髓炎；罕见情况下感染于心脏手术所装的人工瓣膜或静脉吸毒者的自然瓣膜，该菌可引起心内膜炎。

根据国家标准，在化妆品、卫生用品中，铜绿假单胞菌等致病菌不得检出。目前对铜绿假单胞菌的检测多是细菌分离培养和生化鉴定，时间长，操作复杂。随着病原菌核酸检测技术的发展，PCR、荧光实时PCR检测方法也陆续出现。尤其是随着恒温扩增技术快速发展，国外已陆续出现多种原理的恒温扩增技术，如转录依赖的扩增系统TAS、自主序列复制3SR、依赖于核酸序列的扩增NASBA等，这些技术目前只能扩增RNA，在反应过程中需要不断添加酶，而且在产物检测上仍需要复杂的后续程序。链替代扩增SDA，仍需要变性的过程，扩增的靶序列不能超过200bp，后续检测复杂。滚环扩增RCA扩增产物复杂。依赖解旋酶基因扩增HAD，扩增需要三种酶，限制了其应用范围。目前恒温扩增技术中环介导恒温扩增LAMP技术最有优势，只需一种酶、扩增效率高，是目前INAT技术中应用最多、论文发表量最大的方法。但LAMP需要至少6条引物引物设计复杂，产物过于复杂导致假阳性率偏高，且LAMP产物回收测序很困难，且由于日本知识产权的保护，我国在转化应用上局限性较强。

同时常用的核酸检测结果判读方法包括琼脂糖凝胶电泳法、荧光成像法、核酸薄膜层析试纸条法和实时浊度法等方法，但它们都有一个共同的特点即需要专业的仪器，且对操作人员专业水平要求较高。

从待测生物样本中提取核酸是核酸检测的第一步。核酸提取过程一般采用基于胍盐裂解法、硅膜法、磁珠法等各种原理的试剂盒，或者是采用核酸自动化提取仪，但用试剂盒提取核酸费时费力、操作复杂，往往需要2小时以上的时间，不能满足即时检测快速、简便的需求，核酸自动化提取仪能实现高通量且操作简便，但比较笨重、维护成本高。

因此，基于目前已有的检测铜绿假单胞菌的手段存在灵敏度不够及实验条件要求高等缺点，提供一种灵敏、简便、快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒，本试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测铜绿假单胞菌的特点，适合大人流、快速通关背景下的现场检疫查验检测需求，也适合实验室快速检测。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：