[发明专利]一种用于检测甲型H1N1流感病毒的引物组合、试剂盒和PSR方法

权利要求书

1.一种用于检测甲型H1N1流感病毒的引物组合，其特征在于，具体引物序列如下：

6-FP：5’-CCTGTACGACGGCAATGTGGAACAGTGTCATCATTTGAAAGGTTT-3’；SEQ ID NO.21；

6-BP：5’-AAGGTGTAACGGCAGCATGTCCGAATTTCCTTTTTTAACTAGCCAT-3’；SEQ ID NO.22；

6-LF：5’-ACTTGTCTTGGGGAATATCTC-3’；SEQ ID NO.23；

6-LB：5’-ATGCTGGAGCAAAAAGCT-3’；SEQ ID NO.24。

2.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×PSR反应缓冲液、双指示系统和阳性对照。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，2×PSR反应缓冲液含有下列组分：pH8.8Tris-HCl，20mmol；KCl，50mmol；MgSO₄，8mmol；(NH₄)₂SO₄，10mmol；Tween20，0.1％；Betaine，0.8mol。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述双指示系统包括显色液和/或荧光染料；所述显色液包括0.08mM甲酚红和0.02mM苯酚红；所述荧光染料为SYBR GreenI或EveGreen。

6.一种用于检测甲型H1N1流感病毒的PSR方法，其特征在于，包括如下步骤：用权利要求1所述的引物组合对待测样品进行PSR反应，检测PSR反应产物，确定待测样品是否含有甲型H1N1流感病毒。

7.根据权利要求6所述的一种用于检测甲型H1N1流感病毒的PSR方法，其特征在于，所述PSR反应体系如下：2μL模板RNA，2.4μL引物混合液，12.5μL 2×PSR反应缓冲液，3.5μLdNTPs，1.0μLBstDNA聚合酶，1.0μL AMV逆转录酶，以双蒸水补至25μL；

所述引物混合液包括50μmol/L的FP和BP各0.8μL，50μmol/L的LF和LB各0.4μL；

所述dNTPs的终浓度为1.4mmol/L/种；

所述BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶的终浓度均为8U。

8.根据权利要求6所述的一种用于检测甲型H1N1流感病毒的PSR方法，其特征在于，所述PSR反应的反应条件为64-67℃，30-60min。

9.根据权利要求6所述的一种用于检测甲型H1N1流感病毒的PSR方法，其特征在于，所述检测PSR反应产物确定待测样品是否含有甲型H1N1流感病毒的方法为：若能扩增，则待测样品含有甲型H1N1流感病毒；若不能扩增，则待测样品不含有甲型H1N1流感病毒。

10.根据权利要求6所述的一种用于检测甲型H1N1流感病毒的PSR方法，其特征在于，所述检测PSR反应产物确定待测样品是否含有甲型H1N1流感病毒的方法为a、b或c：

a、浊度法：浊度仪检测所述待测样品PSR反应产物浊度变化曲线，若所述待测样品PSR反应产物浊度变化曲线呈上升状态，则所述待测样品为甲型H1N1流感病毒，若所述待测样品PSR反应产物浊度变化曲线不呈上升状态，则所述待测样品不为甲型H1N1流感病毒；

b、显色法：所述PSR反应中加有显色液，观察所述待测样品PSR反应产物的颜色，若所述待测样品PSR反应产物为黄色，则所述待测样品为甲型H1N1流感病毒，若所述待测样品PSR反应产物为红色，则所述待测样品不为甲型H1N1流感病毒；

c.荧光法：所述PSR反应中加有荧光染料，在荧光定量仪中进行扩增反应：若在反应阶段出现S型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰阳性反应的，为阳性；在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现，为阴性；结果判定标准：在阳性对照发生阳性反应且阴性对照发生阴性反应的前提下，待测样品在反应阶段出现S型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰，并与阳性对照单一峰位置接近，此时待测样品判断为阳性，否则为阴性。