[发明专利]一种通用质粒及其构建方法和集胞藻表达外源基因的新方法

权利要求书

1.一种利用Kana抗性基因启动子启动目的基因在集胞藻PCC 6803中串联表达的通用质粒，以及利用此质粒构建的表达纤维素外切酶的基因工程藻。

2.如权利要求1所述的通用质粒，其特征在于，可在大肠杆菌与集胞藻PCC 6803中穿梭表达。利用集胞藻PCC6803的psbA2基因起始密码子ATG前510bp片段作为同源重组载体启动子兼做上游臂，以psbA2基因ORF片段为下游臂，可将目的基因与Kana抗性基因导入到集胞藻PCC 6803并整合到基因组中，在Kana抗性基因与终止子之间插入目的基因，利用Kana抗性基因启动子启动Kana抗性和目的基因在集胞藻内的串联表达，得到可在大肠杆菌与集胞藻PCC6803中穿梭表达，利用Kana抗性基因启动子启动目的基因表达的通用质粒载体P5ST1T2Kana，实现外源基因在集胞藻中的表达。

3.如权利要求1所述的通用质粒，其构建步骤如下：

(1)质粒构建以质粒P5ST1T2-downstream为基础，用限制性内切酶BamHI处理puc4K质粒回收获得Kana抗性序列，序列如序列表中SEQ ID NO：14所示；

(2)以序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为上下游引物，以步骤(1)回收所得的序列为模板，通过PCR扩增技术获得Kana启动子与Kana抗性基因序列：Promote-Kana，通过引物在Promote-Kana上下游两端分别添加酶切位点BamHI与NheI，获得序列如序列表中SEQ IDNO：15所示；

(3)以序列表中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为上下游引物，以步骤2回收所得的序列为模板，通过PCR扩增技术获得Kana终止子基因序列：terminator，通过引物在terminator上下游两端分别添加酶切位点NheI与BamHI，获得序列如序列表中SEQ ID NO：16所示；

(4)用限制性内切酶BamHI处理质粒载体PUC18，将步骤(2)与步骤(3)所获得的序列在重组酶的作用下连接至酶切纯化回收所得的PUC18质粒中，得到T载质粒puc18-Kana；

(5)，用限制性内切酶BamHI处理质粒载体P5ST1T2-downstream与T载质粒puc18-Kana，将酶切T载质粒puc18-Kana所获得的Pro-Kana-NheI-terminator片段在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，制得可穿梭表达的通用质粒载体命名为P5ST1T2Kana。

4.如权利要求1所述的通用质粒，其特征在于，所述步骤(2)中，扩增引物核苷酸序列如下：

Pro-Kana-F：5’-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCCAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG-3’；

Pro-Kana-R：5’-CCAATTCTGAGGCTAGCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTG-3’；

如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，扩增引物核苷酸序列如下：

Terminator-F：5’-GAGTTTTTCTAAGCTAGC TCAGAATTGGTTAATTGGT-3’

Terminator-R：5’-GAGCTCGGTACCCGGGGATCCAAAACGACGGCCAGTGAATT-3’

扩增体系如下：

正反向引物各1μL，模板1μL，重组酶12.5μL，ddH2O 9.5μL，总体系共25μL；

扩增反应条件如下：

94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃复性15s，72℃延伸1.5min，30个循环后；72℃10min，4℃保；

酶切反应体系如下：

DNA 3μL，内切酶1μL，10×Buffer1μL，ddH2O 5μL，总体系共10μL。

5.本发明还涉及如权利要求1-4所述通用质粒在集胞藻中表达外源基因中的应用。