[发明专利]低起始量血浆游离DNA甲基化建库试剂盒及方法

权利要求书

1.一种甲基化建库方法，包括步骤：

(1)对核酸样品同时进行末端修复和加A反应；

(2)将步骤(1)产物进行甲基化接头连接；

(3)将步骤(2)产物进行酶法甲基化处理，所述酶法甲基化处理步骤依次为TET酶处理、终止TET酶反应、DNA变性处理、胞嘧啶脱氨酶处理；

(4)将步骤(3)产物进行PCR扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，核酸样品中DNA含量低至1ng。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：甲基化接头连接试剂包括T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、甲基化接头；

可选的，T4 DNA连接酶缓冲液包括40-80mM Tris-HCl、8-15mM MgCl₂、3-7mM DTT、0.8-1.5mM ATP。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：甲基化接头连接试剂进一步包括DNA连接酶增强液，所述DNA连接酶增强液包括如下a)或b)的组成：

a)氯化六氨合钴

b)氯化六氨合钴和甜菜碱；

可选的，氯化六氨合钴在反应体系的初始浓度为0.1-1mM；

可选的，甜菜碱在反应体系的初始浓度为0.5-3M。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：末端修复和加A反应是一步反应；

所述一步反应的试剂包括：ER/dA酶混合液、ER/dA反应缓冲液；

可选的，ER/dA酶混合液包括T4多核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶；

可选的，在反应体系中的初始浓度：T4多核苷酸激酶为0.2-1U/μl，Taq DNA聚合酶为0.01-0.8U/μl，T4 DNA聚合酶为0.1-1U/μl；

可选的，ER/dA反应缓冲液包括：dATP、dNTP、Tris-HCl、MgCl2、DTT；

可选的，在反应体系中的初始浓度，dATP为0.1-1nmol/μl、dNTP为0.1-1nmol/μl、Tris-HCl为50-100mM、MgCl2为5-20mM、DTT为2-10mM。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

可选的，步骤(3)的酶法甲基化处理试剂包括Enzymatic Methyl-seq Kit；

可选的，步骤(4)的PCR扩增试剂包括i5 Index Primer，Universal Primer和KAPAHiFi HotStart Uracil+ReadyMix。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

可选的，在接头连接、终止TET酶反应、胞嘧啶脱氨酶处理至少一种步骤后还包括纯化步骤。

8.一种甲基化建库试剂盒，包括：

末端修复和加A反应试剂、甲基化接头连接试剂、酶法甲基化处理试剂、PCR扩增试剂；

所述试剂如权利要求3-6任一项所定义。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括纯化试剂。

10.DNA连接酶增强液，包括如下a)或b)的组成：

a)氯化六氨合钴

b)氯化六氨合钴和甜菜碱；

可选的，氯化六氨合钴在反应体系的初始浓度为0.1-1mM；

可选的，甜菜碱在反应体系的初始浓度为0.5-3M。