[发明专利]一种使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶

说明书

本发明公开了一种使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶。该方法使用EDC·HCl作为交联剂，将羧基载体和游离酶通过酰胺键连接，达到固定化的目的。经酶学性质测定发现，与游离脂肪酶比较，本发明制得的固定化脂肪酶IDA‑LIPASE在热耐受性、可重复利用性、保存稳定性方面具有极佳的优势，此外，在该方法下，进行模拟10倍扩大化，当载体量扩大为实验条件的10倍时，固定化酶酶活获得提高，因此具备实际扩大化生产的潜力，利用本发明制备的固定化酶可以在实际应用中发挥较好的催化能力，并且可以为生产降低成本，具有方便、实用、经济的特点，具有重要的研究价值和实用价值。

技术领域

本发明属于生物化工与生物催化技术领域，具体涉及一种使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶。

背景技术

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一类能够催化酯水解、酯交换和酯合成等反应的重要工业酶，近些年来，科研人员发现，脂肪酶在生产生物柴油方面有重要的应用潜力，为促进脂肪酶在化工、环保、医药等行业的应用，固定化酶使得游离脂肪酶可以抵抗高温、搅拌等高强度的实际工业化条件。具有可操作易分离、经济方便、重复利用、稳定、机械强度高等优势，常用的固定化方法有包埋法、吸附法、交联法、共价结合法。所涉及的载体类型有天然载体(壳聚糖、甲壳素、硅藻土等)、无机载体(玻璃、金属、氧化铝、膨润土、二氧化硅)、新型载体(石墨烯、磁性粒子)。目前没有使用羧基树脂固定化脂肪酶的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用羧基树脂载体固定化脂肪酶的方法及由该方法制备的固定化脂肪酶，该固定化酶具备较好的耐热性、操作稳定性、保存稳定性，具备实际工业化生产的潜力。

本发明采取的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：

将羧基载体、交联剂和脂肪酶溶液混合，进行固定化反应，反应结束后抽滤去除残余酶液和交联剂，得到固定化酶。

所述的羧基载体为LX-1000IDA，尾部具有两个羧基活性基团。

所述的交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)。该交联剂有两个C＝N双键结构，可以与羧基进行反应。

具体的，所述的使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：将干燥的LX-1000IDA羧基树脂载体与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液混合，再加入脂肪酶溶液，混匀，所述的羧基树脂载体与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液、脂肪酶溶液的混合比例是2g:100mL:100mL，于25℃摇床振荡进行固定化反应6h，抽滤，去除残留的交联剂和酶液，得到固定化脂肪酶。

优选，所述的羧基树脂载体量/脂肪酶比例为0.2g:800U。

所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液的质量分数为1.2％，利用pH 4.5且质量分数为0.1％的磷酸盐(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)缓冲液溶解。

所述的游离脂肪酶为海洋假丝酵母脂肪酶(CAS：9001-62-1；Assay≥50000U/g；分子量：67000Da)。利用pH 4.5且质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液配制成浓度为2mg/mL的脂肪酶溶液。

本发明的第二个目的是提供一种使用上述的羧基树脂固定化脂肪酶的方法制得的固定化脂肪酶。