[发明专利]一种艾曲波帕介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法

权利要求书

1.一种艾曲波帕(Eltrombopag，ELB)介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法，其特征在于，包括以下步骤：

配制至少包括细胞培养液、细胞冻存液、ELB母液和MTT溶液在内的试剂；对巨噬细胞Raw264.7进行细胞培养，所述细胞培养包括细胞复苏、细胞传代、细胞冻存和细胞计数；

用MTT法检测不同浓度的ELB母液对所述巨噬细胞Raw264.7细胞增殖的影响，包括：

取对数生长期的巨噬细胞Raw264.7，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清；每皿加入3mL PBS反复吹打巨噬细胞Raw264.7，使其脱落成单细胞悬液，将细胞悬液移入15mL离心管中；1000rpm离心5min；弃上清，加入适量完全培养液，混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数；调整细胞悬液密度，以每孔6000个细胞接种于96孔板中，每孔100μL，96孔板最外圈加一圈PBS；

将铺好细胞的96孔板放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养过夜至贴壁；弃上清，每孔加入200μL含不同浓度药物的细胞培养液，各组浓度均设置6个复孔；

放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育48h；48h后每孔加入20μL MTT溶液，继续孵育4h；弃去上清，每孔加入150μL DMSO，放于摇床上摇10min，使蓝紫色结晶完全溶解；用酶标仪在570nm波长处测吸光度值；

按以下公式计算细胞存活率，绘制不同浓度下的生存曲线，计算ELB作用于巨噬细胞Raw264.748 h后的IC₅₀值；细胞存活率(％)＝(实验组OD–空白组OD/对照组OD–空白组OD)×100％。

2.根据权利要求1所述的ELB介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法，其特征在于，q-PCR法检测巨噬细胞Raw264.7血管生成相关因子mRNA的表达，包括细胞给药实验、细胞中RNA的提取、RNA浓度的测定、RNA的逆转录和q-PCR扩增反应；所述细胞给药实验包括：

取对数生长期的巨噬细胞Raw264.7，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清；每皿加入3mL PBS反复吹打巨噬细胞，使其脱落成单细胞悬液；将细胞悬液移入15mL离心管中；1000rpm离心5min；

弃上清，加入适量PBS，混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数；调整细胞悬液密度，以每1.5×10⁶个细胞接种于60mm的细胞培养皿中，每皿2mL；将培养皿置于细胞培养箱中培养3h使其贴壁；

3h后取出细胞培养皿，弃上清，每皿加入2mL含不同浓度药物的RPMI培养基，药物浓度分别为5μM、10μM，置于培养箱中孵育24h；

取出培养皿，弃上清，每皿加入500μLTrizol试剂，在冰上反复吹打细胞使其完全裂解，将裂解液转入1.5mL EP管中，编号，快速置于-80℃冰箱中保存过夜用于后续实验。

3.根据权利要求1或2所述的ELB介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法，其特征在于，分析ELB母液对所述巨噬细胞Raw264.7细胞VEGF蛋白释放的影响，包括：

取对数生长期的巨噬细胞Raw264.7，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清；每皿加入3mL PBS反复吹打细胞，使其脱落成单细胞悬液；将细胞悬液移入15mL离心管中，1000rpm离心5min；

弃上清，加入适量RPMI 1640混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸取60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数；调整细胞悬液密度，以每12×10⁶个细胞接种于100mm的细胞培养皿中，后用RPMI 1640补至6mL，将培养皿放入37℃、5％CO2培养箱中平衡12h；

12h后取出培养皿，弃上清，对照组每皿加入4mL RPMI 1640培养基，实验组每皿加入4mL含10μM ELB的RPMI 1640培养基，将其置于培养箱中培养24h；

24h后取出培养皿，收集上清置于15mL离心管中，1000rpm离心3min，吸取上清至5mL离心管中，写上标记；利用ELISA检测VEGF蛋白的含量。