[发明专利]一种外周血T细胞的体外扩增培养方法

权利要求书

1.一种外周血T细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）在无血清免疫细胞培养基X-VIVO 15中加入10%的胎牛血清，再加入白介素-2、白介素-15、人CD3单克隆抗体和人CD28单克隆抗体至终浓度依次为75 μg/L、40 μg/L、20 μg/L和20 μg/L，获得外周血T细胞体外扩增培养基；

（2）采用肝素抗凝常规采血手段采集血液；

（3）使用Ficoll密度梯度离心法从采集到的上述血液中离心分离出数量为1.8-2.2 ×10⁷的外周淋巴细胞，将该外周淋巴细胞与上述外周血T细胞体外扩增培养基在36-37 ℃且4.5-5.5% CO₂的条件下静置孵育2-4 d；

（4）将步骤（3）所得的培养物进行离心以收集所有细胞，将该所有细胞加入新鲜的上述外周血T细胞体外扩增培养基中，以5 ×10⁵-5 ×10⁶个细胞/mL的培养密度继续于36-37 ℃且4.5-5.5% CO₂的条件下培养2-3 d，获得CD3阳性为90%以上且数量达到2 ×10⁸的T细胞，进行冻存或继续扩大培养；

（5）根据需要将步骤（4）所得的T细胞进行复苏或继续扩大培养，其中，复苏时用新鲜的上述外周血T细胞体外扩增培养基以1×10⁶个细胞/mL的培养密度重新刺激冻存的上述T细胞，促进T细胞的再次激活扩增；复苏之后的培养或上述继续扩大培养的具体培养为：每2-3d以5 ×10⁵-5 ×10⁶个细胞/mL的培养密度接种换液，培养至细胞数达到目的扩增量，收集细胞，培养条件与步骤（4）相同。

2.一种外周血T细胞体外扩增培养基，其特征在于：由无血清免疫细胞培养基X-VIVO15、胎牛血清、白介素-2、白介素-15、人CD3单克隆抗体和人CD28单克隆抗体组成，其中，胎牛血清的加入量为无血清免疫细胞培养基X-VIVO 15的10%，白介素-2、白介素-15、人CD3单克隆抗体和人CD28单克隆抗体的终浓度依次为75 μg/L、40 μg/L、20 μg/L和20 μg/L。