[发明专利]一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法和应用有效
| 申请号： | 201910965879.6 | 申请日： | 2019-10-12 |
| 公开（公告）号： | CN110616271B | 公开（公告）日： | 2022-05-03 |
| 发明（设计）人： | 董姗姗;刘燕;章嫡妮;张振华;卢晓强;于赐刚 | 申请（专利权）人： | 生态环境部南京环境科学研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司： | 合肥中谷知识产权代理事务所(普通合伙) 34146 | 代理人： | 洪玲 |
| 地址： | 210000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 定量 检测 环境 中红耳龟 生物量 特异性 引物 及其 方法 应用 | ||
1.一种利用特异性引物定量检测环境中红耳龟的方法，其特征在于，使用所述特异性引物对待检测环境样本的DNA进行ddPCR扩增，所述特异性引物的序列为：
正向引物KM216748F2：5’-TCTTCTAGGGTAAATCCTATTG-3’
反向引物KM216748R2：5’-AACAGTAGCCATCATTGAACTAGG-3’；
方法包括以下步骤：
步骤S1、提取待检测环境样本的DNA；
步骤S2、以提取的环境DNA为模板，以KM216748F2和KM216748R2为特异性扩增引物，进行ddPCR扩增；
步骤S3、利用微滴分析仪对扩增产物进行荧光检测和分析，并通过QuantSoft软件计算目标基因的拷贝数浓度。
2.根据权利要求1所述的定量检测环境中红耳龟的方法，其特征在于，所述步骤S1中待检测环境样本的DNA为待检测水体环境或土壤环境样本的DNA。
3.根据权利要求1所述的定量检测环境中红耳龟的方法，其特征在于，所述步骤S2中ddPCR的扩增反应体系包括：10μl的2X ddPCR EvaGreen Supermix、5μl的无菌去离子水、浓度为10μM的正反向引物各1.5μl，以及2μl DNA模板。
4.根据权利要求3所述的定量检测环境中红耳龟的方法，其特征在于，所述步骤S2中ddPCR的扩增反应程序为：50℃热激活120s；95℃预变性120s；95℃变性3s，55℃退火及延伸30s，共40个循环。
5.一种如权利要求1所述的利用特异性引物定量检测环境中红耳龟的方法在定量检测环境中红耳龟生物量中的应用。
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