[发明专利]脐带华通氏胶间充质干细胞成骨定向分化的方法

权利要求书

1.一种脐带华通氏胶间充质干细胞成骨定向分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

组织消化：将获取的脐带剪成2~3cm，用酒精浸泡1~3min，用组织保护液进行清洗，剥离脐带的静脉和动脉，分离出脐带华通氏胶组织；将脐带华通氏胶组织剪至1mm³以下的碎块，加入组织消化液消化28~32min，消化后在温度4±1℃、转速900~1100 rpm下离心4~6min，去除上清液，保留沉淀，重悬，获得脐带间充质干细胞悬液；所述组织保护液由生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B和红细胞裂解液配制而成，其中硫酸庆大霉素的浓度为25μg/mL，两性霉素B的浓度为5μg/mL，红细胞裂解液的体积百分数为5%；所述组织消化液以Tryple为基底液，胶原酶I的浓度为0.2g/mL，DNA酶的浓度为0.025mg/mL；

初代培养：向脐带间充质干细胞悬液中加入含有双抗的完全培养基，培养P0代细胞；所述培养P0代细胞时，温度为37±0.5℃，饱和湿度，CO₂浓度为5±1%，培养时间为14~16天，培养期间每隔4~5天更换一次培养基；

传代培养：初代培养后，去除培养液，清洗细胞，加入包括胰蛋白酶和EDTA的消化液进行消化，加入完全培养液终止消化，进行传代培养；所述消化液中胰蛋白酶的质量百分数为0.04%~0.06%，EDTA的质量百分数为0.003%~0.005%；所述传代培养过程中，当细胞融合度达到60%~70%时传代一次，传至P3代；

诱导培养：取传代细胞，消化，终止消化，离心，去掉上清液，保留沉淀，向沉淀中加入完全培养基重悬，接种细胞悬液，培养至预定时间，更换为成骨细胞分化诱导培养基；细胞悬液的浓度为2×10⁴个/mL；所述成骨细胞分化诱导培养基中，血清替代物的质量百分数为10%，地塞米松的浓度为10nM，β-磷酸甘油的浓度10M/mL，抗生素的质量百分数为1%，细胞因子IL-β 的浓度为25ng/mL，抗坏血酸的浓度为105mM/mL，异黄酮的浓度为10μg/mL；每隔2~4天更换一次成骨细胞分化诱导培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还可以将所述脐带华通氏胶组织进行储存；储存时，先在脐带华通氏胶组织中加入冻存液，然后通过程序降温仪降温至-80~-90℃，放置液氮中长期存储。