[发明专利]一种用于地中海贫血突变型与缺失型基因检测的引物组、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于地中海贫血突变型与缺失型基因检测的引物组、试剂盒及其应用，其中，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.32所示的引物；所述试剂盒包括上述的引物组。本发明针对HBA1和HBA2以及HBB三个基因的外显子、调控、转录区设计引物,引物扩增区域包含常见缺失位点和突变位点，并且包括新突变位点在内的500多个位点，远超现有检测方法所检测到突变数量；同时本发明克服了缺失型和突变型地贫的检测差异性，在同一PCR反应中同时扩增缺失型和突变型，不仅能检测已知的突变位点和热点位点，同时可发现新的突变位点，操作简单，降低试剂成本。

技术领域

本发明涉及地中海贫血检测技术领域，具体涉及一种用于地中海贫血突变型与缺失型基因检测的引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

地中海贫血(thalassemia，简称地中海贫血)是由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白链合成减少或缺如，使形成血红蛋白的α-链/α-链比例失衡，而导致的一组严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病，是一组全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病，也是世界卫生组织推荐进行重点预防的遗传病，主要发生在地中海沿岸国家、东南亚、非洲和我国南方地区，保守估计全世界地中海贫血基因携带者近2亿人，其中包括我国南方广西、广东、海南等省份。地中海贫血主要包括α-地中海贫血和β-地中海贫血，在广西、广东，α-地中海贫血基因的人群携带率分别高达17.55％、8.53％。由于此病的普遍性、人口基数大、涉及范围广，包括我国南方在内的重症地中海贫血患儿的出生是世界公认的公共卫生问题。此病目前缺乏有效治疗手段，应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。国家科技部在出生缺陷领域“973计划”和“十一五”科技支撑计划中将该病列入重点防治对象；卫生部也己决定于2010年开始，在广西实施全民筛查及相应预防控制措施。

地贫检测的方法主要有包括：Gap-PCR(跨越断裂点PCR)、PCR-RDB(PCR-反向点杂交)、实时荧光定量PCR、PCR-ASO(PCR反应结合寡核苷酸探针进行斑点杂交)、微阵列芯片法；这些方法普遍操作简单，成本低，但是Gap-PCR只能用于检测缺失型地贫，而PCR-RDB、实时荧光定量PCR、PCR-ASO等方法也只能检测已知的17-20种突变。

PCR+测序方法(PCR-sequencing)，其优点是检测多种突变类型、结果准确且可以发现新的突变类型，缺点是检测成本高、需要配套相应设备。已经报道的采用高通量测序方法检测地贫，在PCR扩增时也会把引物分成2-5个引物组，这样完成一个样本缺失型和突变型位点的检测需要2-5个PCR反应，增加试剂成本，并且操作繁琐。

目前常规的检测技术是gap-PCR技术，具有以下几个明显的技术瓶颈：第一，此方法必须以一对引物，一个PCR反应检测一种缺失类型的分子诊断方式，对各已知缺失类型分别逐一定性检测，因此，对于未知的新缺失类型，务必造成漏检；况且，目前所发现的缺失类型己超过30种，用30多个PCR反应检测一个标本也不现实，一般情况下，只是检测本地区几种常见的缺失类型，如果被检测个体表型正常且没检测到这几种常见缺失类型，也就不会再做进一步的检测而报告阴性结果，这样，必然漏检那些由少见缺失类型所引起一个α珠蛋白基因缺失的静止型α-地中海贫血携带者，此携带者与一标准型α-地中海贫血携带者婚配，就有1/4的概率出生一个HbH患儿，这正是目前所面临的一个严峻公共卫生问题。第二，由于α珠蛋白基因簇的高GC含量及基因间高度同源的结构特殊性，加上各缺失类型的缺失范围不等、缺失长度不一，有的缺失类型断裂点不明等诸多原因，致使针对各种缺失类型的PCR扩增体系与扩增条件不同，有的PCR反应涉及到长片段、高GC含量，需使用特殊的Taq酶及PCR添加剂等，有的须用降落PCR、扩增时间延长等；在某些情况下，由于使用了特殊的扩增体系，甚至难以保证PCR有效扩增而有可能导致假阴性出现：并且，由于不同缺失类型的反应体系与反应条件各不相同，也就难以设计合适的多重PCR体系来同时扩增检测多个缺失类型；所以，这种定性方式的分子诊断途径检测难度大、成本高、操作繁琐、检测通量小，且难以实现自动化和标准化。