[发明专利]基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用

说明书

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用，特别是在RNA病毒敲降方面的应用。本发明利用mCherry荧光报告基因，将PRRSV病毒ORF4和ORF5两个表达阅读框序列分别融合到mCherry基因的碳端构建筛选CRISPR‑Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的荧光报告系统，利用CRISPR‑Cas13d高效切割mRNA的特性，进行高效率sgRNAs的快速筛选。然后利用筛选出的高效靶向结合的sgRNAs进行CRISPR‑Cas13d系统高效降解PRRSV‑GFP重组病毒。本发明提供的RNA病毒敲降方法具有高效率，高精准率及低脱靶率的优势。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体地说，涉及一种基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用。

背景技术

RNA病毒是一类严重危害人类健康，农业安全生产的病毒。由于其具有高度变异，快速复制，生命活动复杂等特点，RNA病毒的防控及相关疾病的治疗变得尤为艰难。常见RNA病毒及相关疾病的主要防治方法为疫苗、抗体的研发以及RNA干涉技术(RNAi)，但效果都不是很理想，新方法的探索及开发迫在眉睫。

近年来，可编程核酸酶介导的基因编辑技术迅猛发展，CRISPR(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)系统基因编辑技术广泛应用于生物学、基础医学等研究领域中，充分证明了该技术具有巨大的发展潜能。CRISPR系统是细菌和古生物菌免疫防御机制的一部分，在外源的质粒或病毒入侵宿主后，CRISPR通过内部的间隔序列来识别这些外源DNA，并形成记忆。当噬菌体再次入侵时，CRISPR区域内一段序列转录成前体的RNA(pre-crRNA)，pre-crRNAs受到转录活化RNA(tracrRNA)转录活化成为小的成熟的crRNA，结合相关的Cas蛋白形成crRNA-Cas蛋白复合体，再通过碱基互补配对精确的与目标DNA结合，从而指导Cas蛋白对目标DNA进行切割，并由这些核酸内切酶造成靶向的DNA双链断裂(DSBs)。经非同源末端连接(NHEJ)途径修复会出现非特异性的碱基缺失、插入或其他形式突变；DSBs也可利用DNA修复模板，如单链寡聚核苷酸(ssODN)在切割酶切位点经同源重组修复(HDR)纠正突变或是插入新的基因序列[Hsu et al.,2014；Kim and Kim,2014；Komor et al.,2017]。以Cas9蛋白作用的II型CRISPR系统，由于不需要复杂的蛋白复合体，且系统组成简单而广泛应用于哺乳动物的基因编辑中[Barrangou RDoudna JA,2016；Komor et al.,2017]。

最新研究表明，Ⅱ类VI型CRISPR效应蛋白Cas13d蛋白可高效切割ssRNA(SilvanaKonermann et al.,2018)。Rfx-Cas13d属于含有2个HEPN核酶基序的2型CRISPR-Cas蛋白家族，长度仅约930aa，是目前最小的2型CRISPR效应物。与其他Cas13酶一样，Cas13d同源物能独立地将CRISPR序列加工成向导RNA。它们依赖crRNA来切割目标，而不依赖HEPN结构域。这些酶对目标的侧翼序列没有要求，因此可以靶向任何RNA序列。CRISPR-Cas13d基因编辑工具的出现将为RNA病毒的敲降提供新的策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用。

发明人基于CRISPR-Cas13d系统介导的ssRNA切割，尤其是Rfx-Cas13d(CasRx)介导的ssRNA切割的高效性，精准性和特异性，提供一种RNA病毒的敲降策略：通过CRISPR-Cas13d系统对mCherry-ORF4/ORF5报告质粒mRNA的切割筛选高效sgRNA，利用筛选出的高效sgRNA进行PRRSV-GFP重组RNA病毒的高效敲降，抑制RNA病毒的复制，从而实现对RNA病毒防治。